Extrakte von Sclerocarya birrea (US8445040B2)

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen wasserlösliche Extrakte, die aus der Sclerocarya birrea Früchte und Verwendungen davon.

Die Marula (Sclerocarya birrea, Familie: Anacardiaceae) ist ein mittelgroßer bis großer Laubbaum mit aufrechtem Stamm und runder Krone. Die Pflanze wird heute wie in der Antike als Nahrungsquelle verwendet. Die Frucht der Marula ist essbar, wird normalerweise roh gegessen oder zu einer Vielzahl von Nahrungsmitteln wie Gelee verarbeitet und auch zu einem alkoholischen Bier gebraut, das von den Vhavenda als Mukumbi bekannt ist.

Medizinische Verwendungen und Anwendungen der Marula umfassen die Verwendung von Rinde und Blättern zur Behandlung von bakterienbedingten Krankheiten und Diabetes [1,2] und auch Durchfall, wie in der australischen Patentveröffentlichung Nr. 2000/29790 [3].

Internationale Veröffentlichung Nr. WO 03/092634 [4] offenbart die Verwendung von Marulaöl in topischen Zubereitungen zur Hemmung der Bildung von Narbengewebe auf der Haut.

Es wurde gezeigt, dass die Marula-Frucht eine erhöhte antioxidative Gesamtkapazität besitzt [5], die Fähigkeit hat, die Phospholipidperoxidation zu hemmen und Superoxid-Anion-Radikalfänger-Aktivität zu haben [6]. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 06/097806 [7] offenbart, dass verschiedene Teile der Marula-Pflanze wie Rinde, Blätter, Früchte, Wurzeln und Samen hydrophobe Antioxidantien enthalten, die durch Mazeration und/oder Extraktion aus der Pflanze gewonnen werden können.

Veröffentlichungen

Obwohl berichtet wurde, dass die Marula-Frucht reich an Antioxidantien ist, wurde bisher nicht über die Herstellung und Verwendung von Extrakten der Marula-Frucht bei der Behandlung von Krankheiten und Störungen wie Arteriosklerose und neurodegenerativen Erkrankungen berichtet.

Die hier offenbarten überraschenden Ergebnisse zeigen, dass die aus Marula-Saft hergestellten Extrakte nicht nur über lange Zeiträume stabil sind, sondern, was noch wichtiger ist, andere und in einigen Fällen bessere therapeutische Vorteile besitzen als die, die der unbehandelte Marula-Saft aufweist. Es hat sich gezeigt, dass die Extrakte der Erfindung die Blutfette günstig beeinflussen, wie durch eine Verringerung des Serum-LDL, durch eine Erhöhung des Serum-HDL und durch eine Abschwächung des oxidativen Stresses im Serum gezeigt wird; die Extrakte haben Wirksamkeit bei der Behandlung von Schäden durch oxidativen Stress, Atherosklerose, Neurodegeneration und damit verbundenen Störungen gezeigt.

Die Marula-Saft-Extrakte der vorliegenden Erfindung sind auch wirksam, um Neurodegeneration zu verhindern, wie durch ihren schützenden Einfluss auf neuronale Zellen, die Schäden durch freie Radikale ausgesetzt sind, bewiesen wird.

Die vorliegende Erfindung offenbart auch die Verwendung von Marula-Saft-Extrakten als Antioxidantien zur Verwendung in einer großen Vielzahl von Anwendungen, z. B. Verwendung in Nahrungsergänzungsmitteln, um z. B. eine antiatherogene Wirkung bei gesunden und nicht gesunden Subjekten (Menschen und nicht Menschen) und als Mittel zur Behandlung oder Vorbeugung von neurodegenerativen Begleiterkrankungen.

Somit wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Extrakt bereitgestellt, der von der Marula-Frucht stammt, ausgenommen den Samen, wobei der Extrakt durch ein Verfahren erhalten wird, das das Unterziehen von aus der Marula-Frucht gesammeltem Saft einer Extraktion mit einem oder mehreren wässrigen Stoffen umfasst Lösung, ein organisches Lösungsmittel und eine Mischung davon, d. h. um dadurch aus dem Marula-Saft einen Extrakt mit den gewünschten biologischen Vorteilen zu erhalten.

Der aus der Marula-Frucht gewonnene Marula-Saft kann vor der Extraktion filtriert werden, um Fruchtreste wie Samenreste und andere unlösliche Stoffe zu entfernen. Die Filtration kann unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten Verfahrens zum Filtrieren von Getränken durchgeführt werden, wie etwa, aber nicht beschränkt auf, Diatomeenerde(DE)-Filtration und Membranfiltration.

In einigen Ausführungsformen wird der aus der Marula-Frucht gewonnene Marula-Saft vor der Extraktion pasteurisiert, um das mikrobielle Wachstum im Saft zu verlangsamen, indem die Anzahl der darin enthaltenen lebensfähigen Krankheitserreger verringert wird. Typischerweise wurde die Pasteurisierung durchgeführt, indem der Saft Temperaturen unterhalb des Siedepunkts ausgesetzt wurde. In einigen Ausführungsformen wird die Pasteurisierung durch ein oder mehrere andere Pasteurisierungsverfahren erreicht, die im Stand der Technik bekannt sind, z. B. kontrolliert durch nationale Lebensmittelsicherheitsbehörden (wie das USDA in den Vereinigten Staaten und die Food Standards Agency im Vereinigten Königreich). Einige nicht einschränkende Beispiele umfassen Hochtemperatur/Kurzzeit(HTST)-Pasteurisierung, Extended Shelf Life(ESL)-Pasteurisierung, Ultrahochtemperatur(UHT- oder ultra-hitzebehandelt)-Pasteurisierung und Chargen- oder Bottich-Pasteurisierung.

Der Begriff „Extrakt“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein wasserlösliches Produkt, das aus irgendeinem Teil der Marula-Frucht oder einem davon abgeleiteten Teil gewonnen wird, mit Ausnahme des Samens, aber einschließlich eines oder mehrerer von Mesokarp, Endokarp, Rinde (dicke Außenhaut), und/oder Haut (Exokarp), durch Anwendung eines Verfahrens ausgewählt aus Expression, Absorption, Mazeration, Lyophilisierung, Destillation und jeder Kombination von zwei oder mehr dieser Verfahren.

Die extrahierten Substanzen können einzeln oder in Kombination zu jeder gewünschten Formulierung geformt werden, einschließlich einer wässrigen Lösung, eines Feststoffs, wie z. B. eines trockenen Pulvers, eines Granulats oder Pellets, eines Konzentrats, z durch Verdampfen des gesamten oder fast des gesamten flüssigen Inhalts des Extrakts oder einer anderen Form erhalten werden. Im Allgemeinen können die Methoden der Materialextraktion variieren sinngemäß abhängig vom Alter der Marula-Frucht, dem Subtyp, der Erntezeit, der Wachstumsregion, den zu extrahierenden Stoffen, ihrer Stabilität und anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind.

In einigen Ausführungsformen wird der Extrakt der Erfindung erhalten, indem der Marula-Saft mit einer wässrigen Lösung in Kontakt gebracht wird, um daraus einen oder mehrere Inhaltsstoffe oder eine Kombination davon zu extrahieren. Die „wässrige Lösung“ kann ganz allgemein Wasser (in einigen Ausführungsformen Wasser mit unterschiedlichen natürlichen Mineralkonzentrationen) oder destilliertes oder anderweitig gereinigtes (destilliertes oder durch irgendein anderes Verfahren gereinigtes) Wasser, eine wässrige Salzlösung, die ein oder mehrere Salze umfasst, oder a Gemisch aus Wasser mit einem oder mehreren wassermischbaren polaren Lösungsmitteln, z. B. C₁-C₄ Alkohole und Ketone.

In einigen Ausführungsformen ist das wässrige Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und mindestens einem Alkohol. In einigen weiteren Ausführungsformen ist das wässrige Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und Ethanol, wobei das Wasser:Ethanol-Verhältnis eines von 1:1, 1:2 ist. . . 1:5 . . . 1:10 . . . 1:100 . . . 1:1.000 . . . usw. bzw. 2:1, 3:1 . . . 5:1. . . 10:1. . . 100:1 . . . 1.000:1 usw. Jedes andere Zwischenverhältnis ist ebenfalls enthalten.

Die Extraktion kann alternativ ein organisches Lösungsmittel allein oder in Kombination mit einem anderen solchen Lösungsmittel verwenden. In einigen Ausführungsformen ist das Extraktionsverfahren ein mehrstufiges Verfahren, wobei die Marula-Frucht (Saft) zuerst mit einem Lösungsmittel und dann mit einem anderen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, um die Ausbeute zu maximieren oder den Extrakt mit einer oder mehreren gewünschten Komponenten anzureichern.

Typischerweise ist das organische Lösungsmittel mindestens ein Alkohol wie Methanol, Ethanol und Isopropylalkohol oder ein Keton wie Aceton. Wenn Ethanol verwendet wird, kann es als wässrige ethanolische Lösung verwendet werden, z. B. mit zwischen etwa 40 bis 60 % Ethanol. Ähnliche Lösungen können auch mit den anderen wassermischbaren organischen Lösungsmitteln verwendet werden. Der aus einem alkoholischen Extrakt erhaltene Extrakt wird hier als Extrakt I bezeichnet.

Es versteht sich im Kontext der vorliegenden Erfindung, dass die ethanolische Extraktion oder jede andere hier offenbarte Extraktion bei jeder geeigneten Temperatur durchgeführt werden kann. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass eine effizientere Extraktion erfolgt, wenn der Saft bewegt wird, beispielsweise durch Rühren oder Schütteln, und/oder wenn die Mischung auf eine Temperatur über Raumtemperatur (über 25–27 °C) erhitzt wird .). Es können auch niedrigere Extraktionstemperaturen, wie solche unter Raumtemperatur, verwendet werden. In einigen Ausführungsformen wird der Extraktionsprozess bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur zwischen 25 und 30°C durchgeführt.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte auch verstanden werden, dass die Extraktion für jede geeignete Zeitdauer durchgeführt werden kann.

Ein Fachmann würde ferner erkennen, dass das Verfahren zum Erhalten des Extrakts der Erfindung das Mazerieren der Marula-Frucht beinhalten kann, um kleinere Stücke der ganzen Frucht zu erhalten, aus denen Extrakte durch ein oder mehrere andere Extraktionsverfahren erhalten werden können, wie z Destillation. Alternativ kann der Extrakt durch Auspressen gewonnen werden, nämlich durch Auspressen des Saftes aus der Frucht.

Daher kann in einigen Ausführungsformen vor dem Kontaktieren des Safts mit einem oder mehreren Lösungsmitteln, wie offenbart, die Frucht, d. h. die ganze Frucht, mit Ausnahme des Samens oder eines beliebigen Teils davon, durch Mazeration, Auspressen oder irgendein anderes Verfahren vorbehandelt werden.

Der aus der Marula-Frucht gewonnene Saft kann vor der Extraktion oder Vorbehandlung, z. B. Trocknen, für längere Zeit gelagert werden. Die Lagerung kann bei jeder Temperatur und jedem Zustand erfolgen, unter denen die Frische des Saftes erhalten bleibt und der Abbau verhindert oder minimiert wird. Solche Temperaturen können über oder unter Raumtemperatur liegen. In einigen Ausführungsformen kann der Saft mehrere Wochen in einem Kühlschrank oder mehrere Jahre im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Wenn der Saft eingefroren wird, kann das Verfahren ferner den Schritt des Auftauens des Safts vor der Extraktion oder Verarbeitung umfassen.

Das Trocknen des Safts kann durch Erhitzen des flüssigen Safts unter Vakuum oder unter atmosphärischem Druck auf eine voreingestellte Temperatur, die Raumtemperatur oder über der Umgebungstemperatur sein kann, in einer Charge oder in kleineren Mengen erreicht werden, um den Feuchtigkeitsgehalt zu steuern der Auszug. In einem hierin offenbarten nicht einschränkenden Beispiel wird das Trocknen erreicht, indem der Saft über eine Oberfläche wie ein Tablett gegossen wird, das in einigen Fällen mit einer Folie (z. B. einer Aluminiumfolie) bedeckt ist, um den Saft gleichmäßig zu erhitzen und eine im Wesentlichen gleichförmige Schicht zu erhalten aus getrocknetem Marula-Extrakt.

Das durch Trocknung gewonnene Feuchtkonzentrat (Sirup) ist je nach Konzentration und Art des Extraktes gelblich bis dunkelbraun gefärbt. Das getrocknete Material lässt sich gut pulverisieren und hat je nach Extrakttyp eine hellgoldene bis dunkelbraune Farbe. Das getrocknete Material ist wasserlöslich.

Der danach erhaltene Marula-Extrakt enthält unterschiedliche Mengen an flüchtigem Material, wobei die Mengen von der Länge der Trocknungsdauer und der angewandten Temperatur abhängen. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, enthält das Konzentrat, nämlich in einigen Ausführungsformen der pulverförmige Extrakt, nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile im Vergleich zum ganzen Fruchtsaft eine höhere Konzentration an aktiven Bestandteilen, deren Anwesenheit und Kombination die hohe Aktivität bereitstellt in der ganzen Frucht nicht beobachtet wird und hier gezeigt wird.

Somit wird der Extrakt durch ein Verfahren erhalten, das das Inkontaktbringen von Marula-Saft mit einem wässrigen Lösungsmittel wie definiert umfasst, um eine Suspension zu erhalten, aus der ein flüssiger Extrakt abgetrennt werden kann.

In einigen Ausführungsformen umfasst der Prozess:

In einigen Ausführungsformen wird der gesammelte Saft wie offenbart vor der Extraktion getrocknet oder vorbehandelt.

In weiteren Ausführungsformen kann die Abtrennung des flüssigen Extrakts aus Schritt (iii) durch Zentrifugieren der in Schritt (ii) erhaltenen Suspension erfolgen, um den flüssigen Extrakt als Überstand von einer festen Masse abzutrennen.

In einigen weiteren Ausführungsformen umfasst der Prozess:

In weiteren Ausführungsformen umfasst das Verfahren:

In einigen anderen Ausführungsformen umfasst der Prozess:

Es sollte beachtet werden, dass die Trennung des flüssigen Extrakts mehr als einmal wiederholt werden kann, mit einer zweiten Menge des gleichen oder unterschiedlichen Lösungsmittels, und die aus jedem Schritt erhaltenen Überstände können vereinigt und weiter behandelt werden, um sie zu isolieren, zu konzentrieren oder weiterzuverarbeiten Extrakt. Somit können zwei oder mehr Überstände vereinigt werden und das Lösungsmittel und/oder ein Teil des Wassers kann entfernt werden, beispielsweise durch Verwendung irgendeines Verfahrens zur Lösungsmittelentfernung.

Wenn das Ausgangsfruchtmaterial einen Feststoff enthält oder in Fällen, in denen die Marula-Frucht zu einem getrockneten oder halbgetrockneten Pulver oder einer granulierten Form verarbeitet wurde, kann der Extrakt zumindest in eine feste Phase und eine wässrige Phase getrennt werden, wobei jede Phase eine solche aufweist die hier offenbarte biologische Aktivität.

Der erfindungsgemäße Extrakt, der durch Anwenden eines oder mehrerer hierin offenbarter Verfahren erhalten wird, kann durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale gekennzeichnet sein:

Somit stellt die Erfindung auch einen Marula-Extrakt bereit, der durch eine antioxidative FRAP-Kapazität von mindestens 1.000 und 1.500 mg Vitamin-C-Äquivalenten pro 100 ml gekennzeichnet ist. Dem steht der für den unbehandelten Marula-Saft gemessene FRAP zwischen 260 und 600 mg Vitamin C pro 100 ml gegenüber. mit anderen Worten, die FRAP-Kapazität eines erfindungsgemäßen Extrakts liegt zwischen dem 2- und 3-fachen der im ursprünglichen unbehandelten Saft beobachteten Aktivität.

In einigen Ausführungsformen ist der Extrakt mit der obigen FRAP-Kapazität Extrakt I.

Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Extrakt bereit, der eine an Polyphenol abgereicherte Fraktion aufweist, wobei der Extrakt hierin als Extrakt II bezeichnet wird. Die polyphenolische Fraktion, hier als Extrakt III bezeichnet, kann von dem Marula-Saft beispielsweise durch Chromatographie des Marula-Safts getrennt werden, um Extrakt II (abgereichert) und Extrakt III (abgetrennte phenolische Fraktion) zu erhalten. In einigen Ausführungsformen wird die Abreicherung der polyphenolischen Fraktion durch ein Verfahren erreicht, das das Filtrieren des Marula-Safts umfasst, beispielsweise indem der Saft durch eine oder mehrere Lagen Gaze (von unterschiedlichen Qualitäten, z. B. von offen bis extrafein gewebt, verwendet gemäß Qualität und Quantität des Saftes), gegebenenfalls Zentrifugieren des filtrierten Saftes zur Entfernung von Fruchtrückständen, Aufbringen des klaren Saftes auf eine Chromatographie, z₁₈-gebundenes Silica oder Harze für hydrophobe Wechselwirkung und Umkehrphasenchromatographie, Sammeln der Fraktionen und Kombinieren von Fraktionen mit dem gleichen Gesamtgehalt an löslichen Feststoffen (TSS).

In einigen Ausführungsformen kann die Polyphenolfraktion aus dem für die Chromatographie verwendeten Medium gesammelt werden, z. B. aus den Säulenperlen, durch Mischen des Mediums, z. B. Perlen, mit einer alkoholischen Lösung (Ethanol, Methanol usw.). Die alkoholischen Fraktionen können dann vereinigt und zur Trockne eingedampft werden.

Gemäß einigen Ausführungsformen kann, um einen Extrakt mit einem erhöhten Verhältnis von Polyphenolen:Vitamin C zu erhalten, die polyphenolische Fraktion (d. h. Extrakt III) von dem Saft abgetrennt und dann der an Polyphenol abgereicherten Fraktion (d. h. Extrakt II) zugesetzt werden. . In einigen anderen Ausführungsformen wird Extrakt II mit Extrakt I kombiniert.

In einigen Ausführungsformen ist Extrakt II durch eine antioxidative FRAP-Kapazität von mindestens zwischen 250 und 500 mg Vitamin-C-Äquivalenten pro 100 ml gekennzeichnet.

Wie hierin verwendet, bezieht sich "Polyphenole" auf eine Gruppe von Substanzen, die durch das Vorhandensein von mehr als einer Phenoleinheit oder einem Baustein pro Molekül gekennzeichnet ist. Polyphenole werden im Allgemeinen in hydrolysierbare Tannine (Gallussäureester von Glucose und anderen Zuckern) und Phenylpropanoide wie Lignine, Flavonoide und kondensierte Tannine unterteilt. In einigen Ausführungsformen umfassen die aus dem Makulasaft erhaltenen Polyphenole hydrolysierbare Tannine, Catechine und Hydroxyzimtsäuren und/oder Derivate davon.

In einem anderen ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines Extrakts der Erfindung zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit.

In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung.

In weiteren Ausführungsformen ist der Extrakt der Wirkstoff, der in der Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff vorhanden ist.

Die Wahl eines Trägers wird teilweise durch den speziellen Extrakt sowie durch das spezielle Verfahren bestimmt, das verwendet wird, um die ihn enthaltende Zusammensetzung zu verabreichen. Dementsprechend gibt es eine große Vielfalt geeigneter Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Die folgenden Formulierungen für die orale, Aerosol-, parenterale, subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraperatoneale, rektale und vaginale Verabreichung sind lediglich beispielhaft und in keiner Weise einschränkend.

Zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können bestehen aus (a) flüssigen Lösungen, wie einer wirksamen Menge des Extrakts, gelöst in Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Kochsalzlösung oder Orangensaft; (b) Kapseln, Sachets, Tabletten, Pastillen und Pastillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge des Extrakts als Feststoffe oder Granulat enthalten; (c) Pulver; (d) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit; und (e) geeignete Emulsionen. Flüssige Formulierungen können Verdünnungsmittel, wie Wasser und Alkohole, beispielsweise Ethanol, Benzylalkohol und die Polyethylenalkohole, entweder mit oder ohne Zugabe eines pharmazeutisch annehmbaren Tensids, Suspendiermittels oder Emulgiermittels enthalten. Kapselformen können vom gewöhnlichen hart- oder weichschaligen Gelatinetyp sein, die zum Beispiel Tenside, Gleitmittel und inerte Füllstoffe, wie Lactose, Saccharose, Calciumphosphat und Maisstärke, enthalten. Tablettenformen können eines oder mehrere von Lactose, Saccharose, Mannit, Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure, mikrokristalliner Cellulose, Akazie, Gelatine, Guargummi, kolloidalem Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talk, Magnesiumstearat, Calciumstearat, Zinkstearat umfassen B. Stearinsäure und andere Hilfsstoffe, Farbstoffe, Verdünnungsmittel, Puffermittel, Sprengmittel, Befeuchtungsmittel, Konservierungsmittel, Aromastoffe und pharmakologisch verträgliche Träger. Lutschtablettenformen können den Wirkstoff in einem Aroma umfassen, üblicherweise Saccharose und Akazie oder Traganth, sowie Pastillen, die den Wirkstoff in einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Akazie, Emulsionen, Gele und dergleichen enthalten zusätzlich zu dem Extrakt solche Träger, wie sie im Stand der Technik bekannt sind.

Die Extrakte oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, z. B. pharmazeutische Zusammensetzungen, können allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten zu Aerosolformulierungen verarbeitet werden, die durch Inhalation verabreicht werden. Diese Aerosolformulierungen können in unter Druck stehende akzeptable Treibmittel wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen eingebracht werden. Sie können auch als Pharmazeutika für nicht unter Druck stehende Präparate, wie in einem Vernebler oder Zerstäuber, formuliert werden.

Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und nichtwässrige, isotonische, sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen, und wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel enthalten. Die Verbindung kann in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel in einem pharmazeutischen Träger, wie einer sterilen Flüssigkeit oder Mischung von Flüssigkeiten, einschließlich Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose- und verwandte Zuckerlösungen, einem Alkohol, wie Ethanol, Isopropanol oder Hexadecylalkohol, verabreicht werden. Glykole, wie etwa Propylenglykol oder Polyethylenglykol, Glycerinketale, wie etwa 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, Ether, wie etwa Poly(ethylenglykol) 400, ein Öl, eine Fettsäure, ein Fett Säureester oder Glycerid, oder ein acetyliertes Fettsäureglycerid mit oder ohne Zugabe eines pharmazeutisch annehmbaren Tensids, wie einer Seife oder eines Detergens, Suspendiermittel, wie Pektin, Carbomere, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Carboxymethylcellulose, oder Emulgatoren und andere pharmazeutische Hilfsstoffe.

Öle, die in parenteralen Formulierungen verwendet werden können, umfassen Erdöl, tierische, pflanzliche oder synthetische Öle. Spezifische Beispiele für Öle umfassen Erdnuss-, Sojabohnen-, Sesam-, Baumwollsamen-, Mais-, Oliven-, Petrolatum- und Mineralöle. Geeignete Fettsäuren zur Verwendung in parenteralen Formulierungen umfassen Ölsäure, Stearinsäure und Isostearinsäure. Ethyloleat und Isopropylmyristat sind Beispiele geeigneter Fettsäureester. Geeignete Seifen zur Verwendung in parenteralen Formulierungen umfassen Fettalkalimetall-, Ammonium- und Triethanolaminsalze, und geeignete Detergenzien umfassen (a) kationische Detergenzien wie beispielsweise Dimethyldialkylammoniumhalogenide und Alkylpyridiniumhalogenide, (b) anionische Detergenzien wie z B. Alkyl-, Aryl- und Olefinsulfonate, Alkyl-, Olefin-, Ether- und Monoglyceridsulfate und Sulfosuccinate, (c) nichtionische Detergenzien wie beispielsweise Fettaminoxide, Fettsäurealkanolamide und Polyoxyethylen-Polypropylen-Copolymere, (d) amphotere Detergenzien wie beispielsweise Alkyl-β-aminopriopionate und 2-Alkylimidazolin-quartäre Ammoniumsalze und (3) Mischungen davon.

Die parenteralen Formulierungen enthalten typischerweise etwa 0,5 bis etwa 25 Gew.-% des Extrakts in Lösung. In solchen Formulierungen können geeignete Konservierungsmittel und Puffer verwendet werden. Um die Reizung an der Injektionsstelle zu minimieren oder zu eliminieren, können solche Zusammensetzungen ein oder mehrere nichtionische Tenside mit einem Hydrophil-Lipophil-Gleichgewicht (HLB) von etwa 12 bis etwa 17 enthalten. Die Menge an Tensid in solchen Formulierungen reicht von etwa 5 bis etwa 15 Gew.-%. Geeignete Tenside umfassen Polyethylensorbitanfettsäureester, wie Sorbitanmonooleat und die hochmolekulargewichtigen Addukte von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, die durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol gebildet werden. Die parenteralen Formulierungen können in versiegelten Einzeldosis- oder Mehrdosisbehältern, wie Ampullen und Fläschchen, dargereicht und in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, z. B. Wasser, erfordert , für Injektionen, unmittelbar vor der Anwendung. Unvorbereitete Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.

Die Extrakte und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zu injizierbaren Formulierungen verarbeitet werden. Die Anforderungen an wirksame pharmazeutische Träger für injizierbare Zusammensetzungen sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Sehen Pharmazie und Apothekenpraxis, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pennsylvania, Banker and Chalmers, Hrsg., Seiten 238–250 (1982), und ASHP-Handbuch zu injizierbaren Arzneimitteln, In einem anderen, 4^th Hrsg., Seiten 622-630 (1986).

Zusätzlich können die Extrakte der vorliegenden Erfindung durch Mischen mit einer Vielzahl von Basen, wie emulgierenden Basen oder wasserlöslichen Basen, zu Suppositorien verarbeitet werden. Formulierungen, die für die vaginale Verabreichung geeignet sind, können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen präsentiert werden, die zusätzlich zu dem Wirkstoff solche Träger enthalten, die im Stand der Technik als geeignet bekannt sind.

Wie oben angegeben, können die Extrakte und Zusammensetzungen der Erfindung in irgendeiner Form hergestellt, angeboten und/oder gelagert werden, nämlich in Form einer Flüssigkeit, eines Konzentrats, eines Trockenpulvers, einer Lösung, einer Emulsion oder einer Vorratslösung oder ein Vorratskonzentrat.

In einigen Ausführungsformen dient die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von mindestens einer Krankheit oder Störung, die mit Schäden durch oxidativen Stress verbunden ist.

Oxidativer Stress ist das Ergebnis eines Ungleichgewichts in der Homöostase von Prooxidantien und Antioxidantien, das zur Bildung toxischer reaktiver Sauerstoffspezies führt. Freie Radikale werden gebildet, wenn Sauerstoff mit bestimmten Molekülen interagiert und eine Kettenreaktion von Schäden zwischen wichtigen Zellkomponenten startet. Somit sind Entzündungen und oxidative Prozesse miteinander verbunden. Darüber hinaus kann oxidativer Stress eine Zytotoxizität von Blutzellen induzieren, die Freisetzung von entzündlichen Zytokinen stimulieren und die Produktion von Wachstumsfaktoren induzieren. Oxidativer Stress spielt eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Plaques und kann zusammen mit der inhärenten Gefäßentzündung ein starker Prädiktor für Atherosklerose sein.

Somit bezieht sich "Schädigung durch oxidativen Stress", wie hierin verwendet, auf eine Schädigung von Zellen, Geweben und/oder Organen eines Tieres, einschließlich Menschen, die durch ein Ungleichgewicht zwischen der Produktion von reaktivem Sauerstoff und der Fähigkeit eines biologischen Systems, leicht zu reagieren, verursacht wird die reaktiven Zwischenprodukte entgiften oder entstandene Schäden einfach reparieren. Meistens können Störungen dieses normalen Redoxzustands toxische Wirkungen durch die Produktion von Peroxiden und freien Radikalen verursachen, die alle oder bestimmte Komponenten der Zelle, einschließlich Proteine, Lipide und DNA, schädigen.

In einigen Ausführungsformen ist die Schädigung durch oxidativen Stress mit einer Störung oder einer Krankheit assoziiert, ausgewählt aus Atherosklerose, Parkinson-Krankheit, Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, neurodegenerativen Erkrankungen oder Störungen, Augenerkrankungen, chronischem Müdigkeitssyndrom und anderen.

Atherosklerose, die Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei Menschen mit westlichem Lebensstil, entsteht durch verschiedene Risikofaktoren. Hypercholesterinämie ist ein Hauptrisikofaktor für Atherosklerose, und die Verringerung der Plasmacholesterinkonzentration durch Arzneimitteltherapie verringert die kardiovaskuläre Inzidenz. Die atherosklerotische Läsion ist durch beschleunigten oxidativen Stress und die Bildung einer reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gekennzeichnet, die Lipide in Lipoproteinen sowie in arteriellen Makrophagen angreift. Die oxidative Modifikation von Low-Density-Lipoprotein (LDL) spielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der Atherosklerose. Oxidiertes LDL (Ox-LDL) trägt wesentlich zur Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen bei, da es die Ansammlung von Cholesterin in Makrophagen und die Bildung von Schaumzellen stimuliert. Im Gegensatz zur Atherogenität von LDL stehen die Spiegel von High-Density-Lipoprotein (HDL) im Serum in umgekehrter Beziehung zum Atherosklerose-Risiko. HDL übt eine hemmende Wirkung auf die LDL-Oxidation aus und diese Wirkung kann mit seinem assoziierten Enzym Paraoxonase 1 (PON1) zusammenhängen.

Atherosklerose ist auch der Prozess oder die Störung, bei der sich Plaque auf der Innenseite von Arterien ansammelt, einschließlich solcher im Herzen, Gehirn, Armen, Beinen und Becken. Somit kann sich der Begriff auch auf die fortschreitende Akkumulation von glatten Muskelzellen, Immunzellen (z. B. Lymphozyten, Makrophagen oder Monozyten), Lipidprodukten (z. B. Lipoproteinen oder Cholesterin), zellulären Abfallprodukten, Kalzium oder anderen Substanzen innerhalb der Zellen beziehen innere Auskleidung einer Arterie, was zu einer Verengung oder Verstopfung des Blutgefäßes und zur Entwicklung von Arteriosklerose-assoziierten Erkrankungen führt.

Da sich Atherosklerose in großen und mittelgroßen Arterien manifestiert, wirkt sich eine Behandlung oder Vorbeugung oft auf die Entwicklung eines chronischen Entzündungszustands in den Arterien aus.

Der erfindungsgemäße Extrakt ist daher auch zur Behandlung und Vorbeugung von Zuständen geeignet, einschließlich Atherosklerose der Koronararterien, die eine Koronararterienerkrankung verursacht, Myokardinfarkt, Koronarthrombose und Angina pectoris; Atherosklerose der das Zentralnervensystem versorgenden Arterien, die Schlaganfälle und vorübergehende zerebrale Ischämie verursacht; Atherosklerose des peripheren Kreislaufs, die Claudicatio intermittens und Gangrän verursacht; Atherosklerose einer Arterie des Splanchnikus-Kreislaufs, die mesenteriale Ischämie verursacht; und Nierenarterienstenose.

Somit ist die Zusammensetzung der Erfindung ferner geeignet zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung von mindestens einer Krankheit oder Störung, die mit einem oder mehreren von erhöhten Serum-Lipid-Triglycerid-Konzentrationen, Serum-Cholesterin-Konzentrationen und Serum-Gesamt- und LDL-Cholesterin-Konzentrationen und verringerten HDL- Cholesterinkonzentrationen.

Wie hier verwendet, beinhaltet eine solche Krankheit oder Störung, die mit erhöhten Serumlipidtriglyceridkonzentrationen, Serumcholesterinkonzentrationen und Serumgesamt- und LDL-Cholesterinkonzentrationen und verringerten HDL-Cholesterinkonzentrationen verbunden ist, abnormal hohe Cholesterinspiegel (Hypercholesterinämie) und/oder hohe LDL-Spiegel oder Triglyceride und/oder niedrigere Konzentrationen an funktionellem HDL, wie koronare Herzkrankheit oder andere Formen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie Krankheiten oder Störungen, die die Entwicklung von Atheromen in Arterien beinhalten (d. h. Atherosklerose), wie Hypocholesterinämie, periphere Gefäßkrankheit, Diabetes und Bluthochdruck.

Oxidativer Stress wurde auch mit neuronalem Zelltod in Verbindung gebracht, der mit verschiedenen neurodegenerativen Zuständen verbunden ist. Neurodegenerative Erkrankungen sind Erkrankungen, bei denen Zellen des Gehirns und des Rückenmarks verloren gehen. Normalerweise beginnt die Neurodegeneration lange bevor der Patient irgendwelche Symptome verspürt. Da Gehirnzellen ständig reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, die durch oxidativen Metabolismus erzeugt werden, ist oxidativer Stress auch einer der prädisponierenden Faktoren für neurologische Erkrankungen bei Erwachsenen und wurde mit der Pathogenese einiger dieser Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht.

Der Extrakt oder die Zusammensetzung der Erfindung wird auch zur Behandlung oder Vorbeugung von mindestens einer neurodegenerativen Erkrankung oder Störung verwendet.

Die "neurodegenerativen Erkrankungen oder Störungen" beziehen sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf einen oder mehrere Zustände, bei denen Zellen des Gehirns und des Rückenmarks als Ergebnis einer Verschlechterung von Neuronen oder ihrer Myelinscheide verloren gehen, was im Laufe der Zeit zu einer Funktionsstörung führt und daraus resultierende Behinderungen. Somit beziehen sich die neurodegenerativen Erkrankungen oder Störungen auf Zustände, die Bewegungsprobleme verursachen, wie Ataxie, und auch auf Zustände, die das Gedächtnis beeinträchtigen und mit Demenz zusammenhängen. Einige nicht einschränkende Beispiele für neurodegenerative Erkrankungen oder Störungen umfassen Alkoholismus, Alexander-Krankheit, Alper-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose (Lou-Gehrig-Krankheit), Ataxia Teleangiektasie, Batten-Krankheit (auch bekannt als Spielmeyer-Vogt-Sjögren-Batten-Krankheit), bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Canavan-Krankheit, Zerebralparese, Cockayne-Syndrom, kortikobasale Degeneration, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, frontotemporale Lobärdegeneration, Huntington-Krankheit, HIV-assoziierte Demenz, Kennedy-Krankheit, Krabbe-Krankheit, Lewy-Körper-Demenz, Neuroborreliose, Machado- -Joseph-Krankheit (spinozerebelläre Ataxie Typ 3), multiple Systematrophie, multiple Sklerose, Narkolepsie, Niemann-Pick-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit, Pick-Krankheit, primäre Lateralsklerose, Prionenerkrankungen, progressive supranukleäre Lähmung, Refsum-Krankheit, Sandhoff-Krankheit, Kinderkrankheit, subakute kombinierte Degeneration des Rückenmarks als Folge einer perniziösen Anämie, spinozerebelläre Ataxie, spinale Muskelatrophie, Steele-Richardson-Olszewski-Krankheit und Tabes dorsalis.

In noch einem anderen ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von mindestens einer Krankheit oder Störung bereit, die mit Schäden durch oxidativen Stress bei einem Säuger verbunden ist, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Extrakts gemäß der Erfindung an den Säuger oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, die diese umfasst.

In einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung mindestens einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die mit einem oder mehreren von erhöhten Serumlipidtriglyceridkonzentrationen, Serumcholesterinkonzentrationen und Serumgesamt- und LDL-Cholesterinkonzentrationen und verringertem HDL verbunden ist -Cholesterinkonzentrationen in einem Säuger, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Extrakts gemäß der Erfindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die diesen umfasst, an den Säuger.

In einem weiteren ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von mindestens einer neurodegenerativ assoziierten Krankheit oder Störung bei einem Säuger bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Extrakts gemäß der Erfindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Verabreichen an den Säuger davon.

In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Antioxidans bereit, das den Extrakt der Erfindung umfasst.

In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein cholesterinsenkendes Mittel bereit, das den Extrakt der Erfindung umfasst.

Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "behandeln und/oder verhindern" auf die Verabreichung einer therapeutischen Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die wirksam ist, um unerwünschte Symptome, die mit einer Krankheit verbunden sind, zu lindern, um deren Manifestation zu verhindern Symptome, bevor sie auftreten, um das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen, die Verschlechterung der Symptome zu verlangsamen, den Beginn der Remissionsphase zu verbessern, den irreversiblen Schaden zu verlangsamen, der im fortschreitenden chronischen Stadium der Krankheit verursacht wird, um den Ausbruch der Krankheit zu verzögern fortschreitenden Stadium, um den Schweregrad zu verringern oder die Krankheit zu heilen, um die Überlebensrate zu verbessern oder eine schnellere Genesung zu erreichen oder um das Auftreten der Krankheitsform zu verhindern, oder eine Kombination aus zwei oder mehreren der oben genannten.

Ein Extrakt oder eine Zusammensetzung der Erfindung kann durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren verabreicht werden. Typischerweise erfolgt die Verabreichung eines Extrakts oder einer diesen umfassenden pharmazeutischen Zusammensetzung in einer wirksamen Menge des Extrakts/der Extrakte, die in der Zusammensetzung enthalten sind. Der „effektive Betrag“ für die Zwecke hierin wird durch solche Erwägungen bestimmt, wie sie in der Technik bekannt sein können. Die Menge muss wirksam sein, um die gewünschte therapeutische Wirkung wie oben beschrieben zu erzielen, abhängig unter anderem von der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung und dem Behandlungsregime. Die wirksame Menge wird typischerweise in geeignet gestalteten klinischen Versuchen (z. B. Dosisbereichsstudien) bestimmt, und der Fachmann wird wissen, wie solche Versuche richtig durchgeführt werden, um die wirksame Menge zu bestimmen. Wie allgemein bekannt, hängt eine wirksame Menge von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Affinität des Liganden zum Rezeptor, seinem Verteilungsprofil innerhalb des Körpers, einer Vielzahl von pharmakologischen Parametern wie etwa der Halbwertszeit im Körper, von unerwünschten Nebenwirkungen, falls beliebig, von Faktoren wie Alter und Geschlecht etc.

Der Extrakt der Erfindung kann auch verwendet werden, um eine Zusammensetzung zur Verwendung in einer Vielzahl von nicht-pharmazeutischen Anwendungen herzustellen. In einigen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine antioxidative Zusammensetzung zur Verwendung als Konservierungsmittel für eine große Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, kosmetischen Industrie, Therapeutika usw. und zur Hemmung von kupferioneninduzierter LDL-Oxidation in vitro oder in vivo.

Der hier offenbarte Extrakt kann zusätzlich als Nahrungsergänzung oder als aktive Komponente einer solchen Ergänzung verwendet werden. In einigen Ausführungsformen ist die Ergänzung für den Verzehr sowohl durch Menschen als auch durch nichtmenschliche Tiere geeignet, für das Management des Wohlbefindens und die Behandlung und Vorbeugung von Zuständen und Störungen, die mit oxidativen Schäden verbunden sind.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann das Nahrungsergänzungsmittel je nach Art und physikalischer Form, z. B. lipophiler oder hydrophiler Natur, ferner einen oder mehrere Emulgatoren, Stabilisatoren, Antioxidantien und andere Zusatzstoffe umfassen. Es werden lebensmittelverträgliche Emulgatoren, wie Phospholipide, beispielsweise Lecithin, Polyoxyethylensorbitanmono- oder -tristearat, Monolaurat, Monopalmitat, Mono- oder Trioleat, ein Mono- oder Diglycerid verwendet. Diese Emulgatoren, Stabilisatoren, Antioxidantien und Zusatzstoffe können dem erfindungsgemäßen Extrakt gemäß der endgültigen Verwendung des Extrakts zugesetzt werden.

Das hier offenbarte Nahrungsergänzungsmittel kann auch synthetische oder natürliche bioaktive Stoffe wie Aminosäuren, Fettsäuren, Vitamine, Mineralien, Polyphenole usw. enthalten, die entweder durch Trocken- oder Nassmischen zu der Zusammensetzung vor der Pasteurisierung und/oder dem Trocknen hinzugefügt werden können.

In einigen Ausführungsformen ist das Nahrungsergänzungsmittel eine vollständige Nahrungsformel, ein Milchprodukt, ein gekühltes oder haltbares Getränk, ein Mineralwasser oder gereinigtes Wasser, ein flüssiges Getränk, eine Suppe, ein Nahrungsergänzungsmittel, ein Mahlzeitenersatz, ein Nahrungsriegel, a Süßwaren, eine Milch oder ein fermentiertes Milchprodukt, ein Joghurt, ein Pulver auf Milchbasis, ein enterales Ernährungsprodukt, eine Säuglingsanfangsnahrung, ein Säuglingsnahrungsprodukt, ein Getreideprodukt oder ein Produkt auf fermentierter Getreidebasis, eine Eiscreme, eine Schokolade, Kaffee, ein kulinarisches Produkt wie Mayonnaise, Tomatenpüree oder Salatdressings oder ein Tierfutter. Gemäß diesen Ausführungsformen kann der Extrakt der Erfindung in den Lebensmitteln oder Getränken dispergiert werden, um eine tägliche Aufnahme an bioaktiven Nährstoffen zu haben, was hauptsächlich von der Art des Lebensmittels abhängt, in dem der Extrakt dispergiert wird, der gewünschten Wirkung und dem Zielgewebe . Die Menge des Nahrungsergänzungsmittels, die von dem Individuum konsumiert werden muss, um eine vorteilhafte Wirkung zu erzielen, hängt auch von einem oder mehreren verschiedenen Faktoren ab, wie der Art des Nahrungsergänzungsmittels und/oder der Nahrung und dem Alter und Gewicht des Verbrauchers.

Das Nahrungsergänzungsmittel zur oralen Verabreichung kann in Kapseln, Gelatinekapseln, Weichkapseln, Tabletten, Dragees, Pillen, Pasten oder Pastillen, Gummis oder trinkbaren Lösungen oder Emulsionen, Sirup oder einem Gel vorliegen, mit einer Dosis von etwa 0,1 to 100 % des erfindungsgemäßen Extrakts, der dann direkt mit Wasser oder auf andere bekannte Weise eingenommen werden kann. Diese Ergänzung kann auch einen Süßstoff, einen Stabilisator, ein Antioxidans, einen Zusatzstoff, einen Geschmacksstoff oder einen Farbstoff enthalten.

Es versteht sich, dass bestimmte Merkmale der Erfindung, die der Klarheit halber im Kontext separater Ausführungsformen beschrieben sind, auch in Kombination in einer einzigen Ausführungsform bereitgestellt werden können. Umgekehrt können verschiedene Merkmale der Erfindung, die der Kürze halber im Kontext einer einzelnen Ausführungsform beschrieben werden, auch separat oder in jeder geeigneten Unterkombination oder wie geeignet in irgendeiner anderen beschriebenen Ausführungsform der Erfindung bereitgestellt werden. Bestimmte im Zusammenhang mit verschiedenen Ausführungsformen beschriebene Merkmale sind nicht als wesentliche Merkmale dieser Ausführungsformen anzusehen, es sei denn, die Ausführungsform ist ohne diese Elemente nicht funktionsfähig.

Wie hierin verwendet, können das Verfahren, der Extrakt oder die Zusammensetzungen der Erfindung zusätzliche Schritte oder Bestandteile oder Teile enthalten, nur wenn die zusätzlichen Schritte, Bestandteile oder Teile die grundlegenden und neuartigen Eigenschaften des beanspruchten Verfahrens, Extrakts und der Zusammensetzungen nicht verändern. Wie hierin verwendet, schließt die Singularform „ein“, „eine“ und „das“ Bezugnahmen auf den Plural ein, es sei denn, der Kontext schreibt eindeutig etwas anderes vor.

Verschiedene Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie sie oben beschrieben und im Anspruchsabschnitt unten beansprucht werden, finden experimentelle Unterstützung in den folgenden Beispielen.

1. Trocknen von Marula-Saft

Marula-Früchte wurden innerhalb von 10 Tagen nach dem Fallen der Früchte von den Bäumen vom Boden gesammelt und dann mit einer hydraulischen Presse unter 35 bar (Enorossi-Olivenpresse Modell 250) gepresst. Der Saft wurde gesammelt und gefroren bei –20°C für unterschiedliche Zeiträume bis zu 3 Jahren gelagert. Unmittelbar vor dem Trocknen wurde der Saft aufgetaut und über Aluminiumfolienschalen gegossen, um eine gleichmäßige Schicht mit einer Dicke von 0,7 cm zu bilden. Schalen, die den Saft enthielten, wurden in einen Vakuumofen (Tuttnauer, ofentrockener Sterilisator Modell 11-900), eingestellt auf 57°C und –760 mm Quecksilbersäule, für einen Zeitraum von 3 Tagen gestellt. Nach dem Trocknen mit etwa 1 % Feuchtigkeit wurde die feste Substanz gemahlen, um ein in Wasser leicht lösliches Pulver zu ergeben. Das Pulver wurde mehrere Monate in einem Exsikkator bei Raumtemperatur aufbewahrt.

2. Zubereitungen aus Marula-Extrakt

A. Ethanolischer Extrakt (hier als „Extrakt I“ bezeichnet)

Zur Herstellung von Extrakt I wurden 15 g getrockneter Marulasaft zu Pulver zerkleinert, in 50 ml 50 %igem Ethanol suspendiert und 20 min auf einen Schüttler gegeben. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand in einen Rundkolben überführt. Der Schritt wurde mit zusätzlichen 25 ml 50 %igem Ethanol wiederholt. Die beiden Überstände wurden vereinigt und das Ethanol sowie ein Teil des Wassers am Rotationsverdampfer entfernt. Die endgültige 30 ml wässrige Lösung hatte eine antioxidative FRAP-Kapazität (Ferric Reduction Antioxidant Power) von 1.390 mg Vitamin-C-Äquivalenten pro 100 ml (das Dreifache der antioxidativen Kapazität im Vergleich zu den 460 mg Vitamin-C-Äquivalenten pro 100 ml, gemessen im ursprünglichen Saft). . Extrakt I kann in Wasser rekonstituiert werden.

B. Polyphenol-abgereicherte Fraktion (hier als „Extrakt II“ bezeichnet):

Zur Herstellung von Extrakt II wurde ganzer Marula-Saft durch 8 Lagen Seihtuch geleitet und zentrifugiert, um Fruchtgewebereste zu entfernen. 200 ml klarer Saft wurden auf eine 20 ml Sepabeads-Säule mit einer Flussrate von 0,4 ml/min aufgetragen. 12-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen, die die gleiche Gesamtkonzentration an löslichen Feststoffen (TSS) wie der klare Saft (12,9 %) enthielten, wurden vereinigt. Die in dieser Fraktion gemessene antioxidative FRAP-Aktivität betrug 379 mg Vitamin-C-Äquivalente pro 100 ml, etwa 83 % derjenigen, die in dem auf die Säule aufgetragenen klaren Saft gemessen wurde.

C. Polyphenolische Fraktion (hierin als „Extrakt III“ bezeichnet).

Zur Herstellung von Extrakt III wurde durch diskontinuierliche Extraktion die Polyphenole von den oben beschriebenen Säulenperlen befreit. Die Kügelchen wurden in einen Glaskolben mit breitem Boden überführt und kräftig mit 85%iger Ethanollösung gemischt. Die ethanolische Lösung wurde gewonnen und der Schritt wurde wiederholt, bis die Extraktionslösung farblos war. Die gesammelten ethanolischen Lösungen wurden vereinigt, in einen Rundkolben gegeben und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der trockene Film wurde in 1 ml Wasser gelöst. Das resultierende Produkt hatte eine FRAP-Aktivität von 5.735 mg Vitamin-C-Äquivalenten pro 100 ml, was etwa dem 12-fachen der im ursprünglichen Saft gemessenen Aktivität entspricht.

Um ein mit Polyphenolen angereichertes Marula-Getränk zu erhalten, wurden 15 ml einer Polyphenol-abgereicherten Saftfraktion (Extrakt II) mit der isolierten Polyphenol-Fraktion (Extrakt III) gemischt; Wasser wurde zu einem Endvolumen von 25 ml Marula-Getränk (umfassend die hierin beschriebenen Extrakte II und III) mit einer antioxidativen FRAP-Aktivität von 446 mg Vitamin-C-Äquivalenten pro 100 ml zugegeben, wovon 50 % durch Vitamin C und 50 % beigesteuert wurden. durch Polyphenole, verglichen mit ~75 % bzw. 25 % im ursprünglichen Saft.

Gesamtpolyphenole wurden spektrophotometrisch nach dem für kleine Volumina modifizierten Verfahren von Singleton bestimmt [Singleton V L, et al., Am. J. Emology and Viticulture 16: 144-158, 1965]. Gallussäure (GA) diente als Standard. GA-Stammlösung wurde in Wasser bei einer Konzentration von 2 mM hergestellt. Für die Standardkurve wurden Volumina von 10, 20, 40 und 60 Mikroliter verwendet. Die Ergebnisse wurden dann als GA-Äquivalente (GAE) ausgedrückt. Gelegentlich ersetzte Pyrogallol GA als Standard.

3. In-vitro-Methoden

FEIGE. 1 zeigt die Gesamtpolyphenolkonzentration in jedem der filtrierten Marula-Safte, ethanolischen Extrakte aus getrocknetem Marula-Saft (Extrakt I) und einem Produkt, das durch Kombinieren der hierin beschriebenen Extrakte II und III erhalten wurde. Die Gesamtkonzentration betrug 7,15, 8,34 bzw. 9,35 mg Gallussäureäquivalente (GAE)/ml.

FEIGE. 2 präsentiert die HPLC-Chromatogramme von Marulasaft und Saftextrakten. Jeder Saftextrakt wurde mit 80 % Methanol, ergänzt mit 2 mM NaF, gewaschen (1:3), um die Antioxidantien zu extrahieren. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand wurde vor der Injektion durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Proben von 20 μl wurden unter Verwendung des LaChrom Merck Hitachi HPLC-Systems analysiert, bestehend aus Pumpe L7100, Säulenofen L7350 (eingestellt auf 28°C), Mischer-Entgaser L-7614 und manuellem Injektor Rheodyne, gekoppelt mit Multiwellenlängendetektor (Jasco MD- 2010 Plus), Schnittstelle (Jasco LC-Net II/ADC) und wissenschaftliche Software (EZChrom Elite Client/Server Version 3.1.6 Build 3.1.6.2433). Eine mit Endkappen versehene Purospher®Star RP-18-Säule (250 × 4 mm LichroCART®-Kartusche, 5 μm Partikelgröße) mit einer mit Endkappen versehenen Lichrospher®100 RP-18-Vorsäule (4 × 4 mm LichroCART®-Kartusche, 5 μm Partikelgröße). ) wurden benutzt.

Das Säulenende wurde mit einem Fraktionssammler (Pharmacia Fine Chemicals, FRAC-100) verbunden. Die mobilen Phasen bestanden aus (A) Phosphorsäure (0,1 %), pH 2,4, und (B) Methanol; der Elutionsgradient wurde so eingestellt, dass er in 30 Minuten von 0 auf 100 % Methanol ging. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,6 ml min⁻¹.

Die Vitamin C-Konzentration wurde aus dem Bereich unter den entsprechenden Chromatogramm-Peaks unter Verwendung von HPLC-Vitamin C (Fluka) zur Kalibrierung bewertet. Methanol war HPLC-Qualität (LiChrosolv Merck); Wasser wurde unter Anwendung bekannter Verfahren gereinigt und filtriert; Phosphorsäure (Frutarom) und NaF (Sigma) waren analysenrein. Die Phenol-Standardbibliothek wurde unter Verwendung von Catechin, Chlorogen-, Kaffee- und Gerbsäure von Sigma und 2-Hydroxybenzoesäure (Salicylsäure), Quercetin-3-β-glucosid und Ellagsäure von Fluka erstellt.

Wie die HPLC-Chromatogramme zeigen, hatte jeder der Extrakte I, II, III eine einzigartige Zusammensetzung in Bezug auf phenolische Verbindungen [Phenolsäuren (PA) und Tannine (T)] und Vitamin C. Die drei Extrakte unterschieden sich signifikant in ihrer antioxidativen Zusammensetzung im Vergleich zum Original Saft.

Die Radikalfängerkapazität der Marula-Saftprodukte wurde auch durch den DPPH-Assay analysiert [Malterud K. M., Farbort T. L., Huse ACE, Bredo Sund R., Antioxidant and radikal scavenging effects of arthraquinones and anthorones. Pharmakologie. 1993: 47: 77-85]. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl) ist eine Substanz, die freie Radikale erzeugt und weithin verwendet wird, um die Fähigkeiten zum Abfangen freier Radikale (die Fähigkeit einer Verbindung, ein Elektron abzugeben) verschiedener Antioxidantien zu überwachen. Das DPPH-Radikal hat aufgrund seines beeinträchtigten Elektrons eine tiefviolette Farbe, und die Radikalfängerung kann spektrophotometrisch durch den Absorptionsverlust bei 517 nm verfolgt werden, wenn die blassgelbe nicht-radikalische Form erzeugt wird.

Aliquots des Marulasaftprodukts (1,0 &mgr;l) wurden mit 1 ml 0,1 mmol DPPH/l in Ethanol gemischt, und die Änderung der optischen Dichte bei 517 nm wurde kontinuierlich überwacht. Die Fähigkeit von Marula-Saft-Extrakten, freie Radikale zu fangen, wurde mit der Fähigkeit von gefiltertem Marula-Saft verglichen, freie Radikale zu fangen (FIG. 3A und 3B).

Bei einer Konzentration von 1,0 μl/ml induzierte filtrierter Marula-Saft eine 30%ige Abnahme der optischen Dichte bei 517 nm, während ein Produkt, das durch Kombinieren der hierin beschriebenen Extrakte II und III erhalten wurde (z. B. Marula-Saft, angereichert mit hohen Gehalten an Polyphenolen) induzierte eine 21%ige Abnahme der optischen Dichte bei 517 nm. Die bemerkenswerteste Radikalfängerkapazität zeigte Extrakt I, der eine 54%ige Abnahme der optischen Dichte bei 517 nm (Feige. 3A). Bei höheren Konzentrationen (2,0 μl/ml) induzierte filtrierter und zentrifugierter Marula-Saft eine 60%ige Abnahme der optischen Dichte bei 517 nm. In ähnlicher Weise induzierte das durch Kombinieren der hierin beschriebenen Extrakte II und III erhaltene Produkt eine 43%ige Abnahme der optischen Dichte bei 517 nm, und die bemerkenswerteste Radikalfängerkapazität zeigte wiederum Extrakt I, der eine 89%ige Abnahme der optischen Dichte induzierte Dichte bei 517 nm (FEIGE. 3B).

LDL wurde aus Plasma isoliert, das von gesunden normolipidämischen Freiwilligen stammte, durch diskontinuierliche Dichtegradienten-Ultrazentrifugation [Aviram, M. (1983) Plasma lipoproteinseparation by diskontinuierlicher Dichtegradienten-Ultrazentrifugation bei hyperlipoproteinämischenPatienten. Biochem. Med. 30, 111-118]. Das LDL wurde bei d = 1,063 g/ml gewaschen, gegen 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L Na dialysiert₂EDTA (pH 7,4) bei 4°C. Das LDL wurde dann durch Filtration (0,45 &mgr;M) sterilisiert, unter Stickstoff im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt und innerhalb von 2 Wochen verwendet. Die LDL-Proteinkonzentration wurde mit dem Folin-Phenol-Reagenz bestimmt. Vor der Oxidation wurde LDL gegen EDTA-freie, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, und bei 4°C dialysiert.

LDL (100 μg Protein/ml) wurde zehn Minuten lang bei Raumtemperatur mit steigenden Konzentrationen von Marulasaftextrakten inkubiert. Dann 5 μmol/L CuSO₄ wurde zugegeben und die Röhrchen wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde das Ausmaß der LDL-Oxidation durch Messen der erzeugten Menge an Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) und an Lipidperoxiden [Aviram M, Vaya J. Marker für die Oxidation von Lipoproteinen niedriger Dichte. Methoden Enzymol. 2001; 335:244-56; und Buege J. A., Aust S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methoden Enzymol. 52: 302-310 (1978)]. Der Lipidperoxid (PD)-Test analysiert die Lipidperoxidbildung anhand ihrer Fähigkeit, Iodid in Iod nach Inkubation für 18 Stunden bei 25°C umzuwandeln, wie spektrophotometrisch bei 365 nm gemessen [G. Jürgens. Ein spektrophotometrischer Assay für Lipidperoxide in Serumlipoproteinen unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Reagens. J. Lipid-Res. 30: 627-630, 1986].

Die LDL-Oxidation wurde als TBARS (FEIGE. 4A) oder als Lipidperoxidbildung (FEIGE. 4B). Die Zugabe steigender Konzentrationen von Marula-Saftextrakten hemmte dosisabhängig die kupferioneninduzierte LDL-Oxidation. Der IC₅₀ (Hemmung der LDL-Oxidation um 50 %) für filtrierten und zentrifugierten Marula-Saft betrug 0,80 μl/ml für die TBARS (FEIGE. 5A) und 0,65 μl/ml für die Lipidperoxide (FEIGE. 5B) Formation. Etwas niedrigere Ergebnisse wurden für Extrakt I erhalten (0,50 &mgr;l/ml sowohl für TBARS als auch für die Bildung von Lipidperoxiden). Im Gegenteil, der IC₅₀ Der Wert für ein Produkt, das durch Kombinieren der hierin beschriebenen Extrakte II und III erhalten wurde, war der höchste (1,35 und 1,50 für die TBARS bzw. für die Lipidperoxide).

J-774A.1-Makrophagen wurden mit 10 und 30 &mgr;g GAE-Äquivalenten/ml Marulasaftprodukten vorinkubiert, und dann wurden die Zellen auf ihre Atherogenität analysiert, die als Makrophagen-Oxidationsstatus, Makrophagenaufnahme von Lipoproteinen, HDL-vermittelter Cholesterinausfluss bewertet wurde und Cholesterinbiosynthese

Der oxidative Status der Makrophagen wurde durch den durchflusszytometrischen Assay mit Dichlorfluorescin-Diacetat (DCFH-DA) bestimmt. DCFH-DA ist ein unpolarer Farbstoff, der in Zellen diffundiert. In den Zellen wird es zu dem nicht fluoreszierenden Derivat 2′,7′-Dichlorfluorescin (DCFH) hydrolysiert, das polar ist und in den Zellen eingeschlossen ist. Unter oxidativem Stress wird DCFH zu DCF oxidiert, einer fluoreszierenden Verbindung. J774 A.1 (2×10⁶) Makrophagen wurden mit 2,5×10 inkubiert⁻⁵ mol/L DCFH-DA für 30 Minuten bei 37°C. Die Reaktion wurde durch Waschen mit PBS bei 4°C gestoppt. Zellfluoreszenz wurde mit einem Durchflusszytometriegerät (FACS-SCAN, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) bestimmt ). Messungen wurden bei 510 bis 540 nm nach Anregung der Zellen bei 488 nm mit einem Argonionenlaser durchgeführt.

Die Inkubation von J-774 A.1-Makrophagen für 18 Stunden bei 37°C mit Extrakt I und filtriertem Marula-Saft reduzierte den zellulären oxidativen Stress, gemessen durch den DCFH-Assay, um 6 % bzw. 7 %. Das durch Kombinieren der hierin beschriebenen Extrakte II und III erhaltene Produkt hatte keine Wirkung auf den oxidativen Stressstatus der Makrophagen (FEIGE. 6).

LDL (1 mg/mL) wurde für 18 Stunden bei 37°C mit 5 μmol/L frisch zubereitetem CuSO inkubiert₄. Die Oxidation wurde durch Kühlung bei 4°C beendet. Das Ausmaß der LDL-Oxidation wurde durch den TBARS-Assay bestimmt.

LDL und Ox-LDL wurden für zelluläre Aufnahmestudien an Fluorisothiocyanat (FITC) konjugiert. Lipoproteine ​​(2,5 mg Protein/ml) wurden über Nacht bei 4°C gegen mehrere Wechsel von Boratpuffer, enthaltend 0,1 M Borat, 25 mM Natriumtetraborat, 75 mM NaCl, pH 8,6, dialysiert. Vor der Konjugation (1 h) wurde der pH-Wert des Dialysepuffers auf 9,4 geändert. Fluoresceinisothiocyanat (FITC; Sigma-Aldrich) wurde in Dimethylformamid (Merck) gelöst und tropfenweise zu der Lipoproteinlösung gegeben, um eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml zu ergeben, und dann 1 h bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. FITC-konjugierte Lipoproteine ​​wurden von unkonjugiertem FITC durch Größenausschlusschromatographie über einer PD-10-Säule (Amersham-Pharmacia Biotech) getrennt, wobei mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, eluiert wurde. FITC-markierte Lipoproteine ​​(2 mg/ml) wurden sofort in Aufnahmestudien verwendet.

J774 A.1-Makrophagen wurden bei 37°C für 3 Stunden mit FITC-konjugiertem LDL oder Ox-LDL bei einer Endkonzentration von 25 &mgr;g Protein/ml inkubiert. Die Aufnahme des Lipoproteins wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Messungen der zellulären Fluoreszenz, bestimmt durch FACS, wurden bei 510 nm bis 540 nm nach Anregung der Zellen bei 488 nm mit einem Argonionenlaser durchgeführt. Die Zellfluoreszenz wurde als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) gemessen.

Die Inkubation von J-774 A.1-Makrophagen für 18 Stunden bei 37°C mit Marulasaftprodukten (10 &mgr;g/ml GAE) hatte keine Wirkung auf die LDL-Aufnahme durch Makrophagen. Bei einer höheren Konzentration von 30 μg/ml GAE reduzierte nur das Produkt, das die hierin beschriebenen Extrakte II und III umfasste, die Makrophagen-LDL-Aufnahme um 9 % (FEIGE. 7). Inkubation von J-774 A.1-Makrophagen für 18 Stunden bei 37°C mit Extrakt I, einem Produkt, erhalten durch Kombinieren der hierin beschriebenen Extrakte II und III und filtriertem Marula-Saft, entweder mit 10 &mgr;g/ml GAE oder 30 &mgr;g/ml GAE, verringerte Makrophagenaufnahme von Ochsen-LDL um 12 % bzw. 7 % (Extrakt I), um 27 % (Marula-Saft mit hohem Polyphenolgehalt) bzw. um 8 % bzw. 6 % (gefilterter Marula-Saft) (FEIGE. 8).

J774 A.1-Makrophagen wurden mit [³H]-markiertes Cholesterin (2 μCi/ml) für 1 Stunde bei 37°C, gefolgt von einer Zellwäsche in eiskaltem PBS (× 3) und weiterer Inkubation in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100 μg HDL-Protein/ml für 3 Stunden bei 37° C. Zellulär und mittel [³H]-Markierungen wurden quantifiziert und der HDL-vermittelte Cholesterinausfluss wurde als Verhältnis von [³H]-Markierung im Medium/([³H]-Markierung im Medium+[³H]-Markierung in Zellen). Die Inkubation von J-774 A.1-Makrophagen für 18 Stunden bei 37°C mit filtriertem Marula-Saft (10 &mgr;g/ml GAE) erhöhte den Cholesterinausfluss von Makrophagen zu HDL um ~10%. Alle anderen Marula-Saftprodukte beeinflussten jedoch den HDL-vermittelten Cholesterinausfluss bei keiner verwendeten Konzentration (FEIGE. 9).

J774 A.1-Makrophagen wurden mit [³H]-Acetat, gefolgt von zellulärer Lipidextraktion mit Hexan:Isopropanol (3:2, v/v) und Trennung durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgelplatten. Die Flecken von unverestertem Cholesterin wurden durch Joddampf sichtbar gemacht, in Szintillationsfläschchen geschabt und auf Radioaktivität gezählt. Inkubation von J-774 A.1-Makrophagen für 18 Stunden bei 37°C mit Extrakt I, einem Produkt, erhalten durch Kombinieren der hierin beschriebenen Extrakte II und III und Marula-Saft nach Filtration, alle bei einer Konzentration von 30 &mgr;g/ml GAE, reduziert Cholesterinbiosynthese in Makrophagen um 18 %, 7 % bzw. 8 % (FEIGE. 10).

Neugeborene Wistar-Ratten wurden von Harlan Laboratories erhalten. Kulturen von primären Ratten-Astrozyten wurden aus den Großhirnrinden von 1-2 Tage alten neugeborenen Wistar-Ratten präpariert. Dieses Verfahren wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Astrozyten wurden in Platten mit 24 Vertiefungen mit 100.000 bzw. 80.000 Zellen/0,5 ml/Vertiefung ausplattiert. Alle Experimente wurden in Gegenwart von 2 % Serum (FCS) durchgeführt. Das ursprüngliche Medium der Zellen wurde abgesaugt und den Zellen frisches Medium zugesetzt. Verdünnungen von H₂Ö₂ und Marula-Säfte im Wachstumsmedium wurden kurz vor jedem Experiment frisch aus Vorratslösungen hergestellt und sofort verwendet. Jede Behandlung wurde in Tetraplicates durchgeführt. Die Endkonzentration von H₂Ö₂ betrug 200 μM.

Neuronale Zellkultur-Assays

Bestimmung der Zelllebensfähigkeit – Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung eines kommerziellen kolorimetrischen Assay-Kits (geliefert von Roche) bestimmt, basierend auf der Messung der Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität, die aus dem Zytosol geschädigter Zellen in den Überstand freigesetzt wird.

Schutzwirkung von Extrakten – Um die optimalen Bedingungen (in Bezug auf Zeit und Dosis) zu bestimmen, unter denen die Säfte ihre vermeintliche Schutzwirkung entfalten können, wurden die Zellen mit unterschiedlichen Mengen jedes Saftprodukts für unterschiedliche Zeiträume und die Schutzwirkung der Produkte gegen oxidativen Stress vorbehandelt generiert von h₂Ö₂ wurden evaluiert. Säfte (in einer Verdünnung von 1:125, 1:500, 1:800 und 1:4000) wurden entweder gleichzeitig mit H₂Ö₂ oder zwei Stunden mit den Zellen vor ihrer Zugabe vorinkubiert. Die Toxizität wurde 20 h später überwacht. FEIGE. 11 zeigt, dass bei allen getesteten Konzentrationen und für alle Saftprodukte die gleichzeitige Zugabe der Säfte mit H₂Ö₂ ist nicht schützend. Eine 2-stündige Vorinkubation mit den Zellen vor H₂Ö₂ Die Zugabe führte zu Schutzwirkungen aller Säfte, wobei Extrakt I die effektivste Schutzwirkung zeigte, wenn er in niedrigen Konzentrationen (1:4000) verwendet wurde.

Experimente mit Marula-Extrakten bei niedrigen Konzentrationen (Verdünnungen 1:1000–1:8000) – Die folgenden Experimente wurden bei niedrigeren Konzentrationen der Produkte (Verdünnungen 1:1000–1:8000) mit ~55–450 μg/100 ml Vitamin durchgeführt C-Äquivalente.

Die Auswirkungen der Vorinkubationszeit (2 h gegenüber 6 h) der Zellen mit den Saftprodukten und der Produktkonzentration (1:1000–1:8000) wurden getestet. FEIGE. 12 zeigt, dass, während 2 Stunden Vorinkubation mit Extrakt I nur ~20 % Schutz bei allen getesteten Konzentrationen verursachten, 6 Stunden Vorinkubation zu mehr als 80 % Schutz führten.

In einem anderen Experiment wurde die Wirkung der Inkubationszeit und der Konzentration mit 2 Verdünnungen (1:1000 oder 1:4000) von jedem Saft, filtriertem Marulasaft und Extrakt I, für 2 oder 6 Stunden vor der Zugabe von H getestet₂Ö₂ (FEIGE. 13). Extrakt I wurde als am effizientesten befunden (70 % Schutz). Gefilterter Marula-Saft zeigte auch eine signifikante Schutzaktivität (40 % Schutz).

4. Klinisches Protokoll

Zehn gesunde Freiwillige (Tabelle 1), Nichtraucher und ohne Stoffwechselstörungen, mit Plasmacholesterinspiegeln unter 200 mg/dl und ohne medikamentöse Behandlung wurden für die Studie rekrutiert. Alle Probanden unterzeichneten vor Eintritt in die Studie eine Einverständniserklärung. Das Studienprotokoll wurde vom Rambam Helsinki Committee (Nr. 2452) genehmigt.

Alle Teilnehmer konsumierten über einen Zeitraum von 3 Wochen täglich 200 ml pasteurisierten Saft zu ihrer Hauptmahlzeit. Alle in die Studie eingeschlossenen Probanden setzten ihren gewohnten Lebensstil fort. Der Blutdruck wurde zum Zeitpunkt Null (vor Studieneintritt), nach 3 Wochen und am Ende der Studie (nach 4 Wochen Auswaschung) gemessen. Blutproben (25 ml) wurden für Analysen zum Zeitpunkt Null (Baseline – vor Studieneintritt), nach 3 Wochen Marula-Saftkonsum und 4 Wochen nach dem Ende des Saftkonsums (Washout) entnommen.

Alle Blutserumproben wurden bis zur Analyse bei –80°C eingefroren. Biochemische Analysen im Serum wurden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Diagnosekits durchgeführt und umfassten die Messung von Glukose, Kalzium, Nierenfunktion (BUN, Kreatinin und die Elektrolyte Natrium und Kalium), Leberfunktion (CK, AST und Gesamtbilirubin), Gesamtcholesterin, HDL —Cholesterin, LDL-Cholesterin und Gesamttriglyceride. Die Harnsäurespiegel (als mögliches Antioxidans) im Serum wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits gemessen.

Oxidative Stressanalysen von Serumproben

Eisen(III)-reduzierendes Antioxidansvermögen (FRAP): Ein funktionierendes FRAP-Reagenz wurde durch Mischen von 25 ml Acetatpuffer, 2,5 ml 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazin (TPTZ)-Lösung und 2,5 ml FeCL hergestellt₃*6H₂O Lösung. Wässrige Lösungen von 1 mM FeSO₄*7H₂O wurde in Konzentrationen von 5, 10, 20, 30, 40, 50 und 100 mM für eine Standardkalibrierungskurve verwendet. FRAP-Reagenz (frisch hergestellt) wurde auf 37°C erwärmt und ein Reagenzleerwert wurde bei 593 nm spektrophotometrisch abgelesen. Serumprobe (30 μl) wurde mit 90 μl Wasser gemischt. Dann wurden 900 μl des FRAP-Reagenzes zugegeben und schnell gemischt. Die Absorption wurde nach 0,5 Sekunden und alle 15 Sekunden während 4 Minuten abgelesen. Die Extinktionsänderung (A_{593 Nanometer}) zwischen der endgültigen und der anfänglichen optischen Dichte wurde für jede Probe berechnet und dann auf Fe bezogen⁺² Konzentration in der Standardkurve (parallel getestet).

Serumlipidperoxidation

Das Serum wurde 1:4 (v:v) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und dann in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100 mmol/l des Radikalbildners 2,2′-Azobis-2-amidinopropanhydrochlorid (AAPH) inkubiert. für 2 Stunden bei 37°C. Die Lipidperoxidation im Serum wurde durch Messen der erzeugten Menge an Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) und an Lipidperoxiden unter Verwendung spektrophotometrischer Verfahren bestimmt. Der Lipidperoxid (PD)-Test analysiert die Lipidperoxidbildung anhand ihrer Fähigkeit, Jodid nach 18-stündiger Inkubation bei 25°C in Jod umzuwandeln, wie spektrophotometrisch bei 365 nm gemessen.

Wie die Ergebnisse der Studie zeigen, hatte der Konsum keinen signifikanten Einfluss auf den Blutdruck; Die Serumspiegel von Glukose und Kalzium waren nach dem Verzehr nicht signifikant verändert und die Nierenfunktionstests wurden durch den fortgesetzten Verzehr nicht signifikant beeinflusst. In ähnlicher Weise führte der Konsum zu einem im Wesentlichen unveränderten Elektrolytblutspiegel und einer unveränderten Leberfunktion. Die Serumtriglyceridspiegel sanken jedoch nach der Einnahme um 7 %, wobei die Wirkung nach der 4-wöchigen Auswaschphase anhielt (Tabelle 2).

Die Einnahme über einen Zeitraum von 3 Wochen verringerte die Konzentrationen von Gesamtcholesterin im Serum signifikant (p < 0,02) um 8 % (Tabelle 3).

Diese Verringerung kann mit einer signifikanten (p < 0,01) Verringerung des LDL-Cholesterinspiegels um 17 % zusammenhängen. Diese Reduktionen hielten jedoch nach der Auswaschphase nicht an, da die Werte des Gesamtcholesterins sowie die des LDL-Cholesterins nach einer 4-wöchigen Auswaschphase, in der der Proband den Saft nicht konsumierte, auf die Ausgangswerte zurückkehrten. Der Serumspiegel von HDL-Cholesterin stieg signifikant (p < 0,03) um 10 % nach dem Konsum des Saftes an und diese Reduktion blieb, wenn auch in geringerem Ausmaß (um nur 7 %), nach der Auswaschphase bestehen.

Tabelle 4 zeigt die Wirkung auf den oxidativen Stress im Serum. Serumproben wurden einer AAPH-induzierten Oxidation unterzogen. Die Bildung von Lipidperoxid war in Serumproben, die nach 3-wöchiger Einnahme entnommen wurden, signifikant (p < 0,03) verringert. Dieser Effekt hielt jedoch nach der Auswaschphase nicht an. In Serumproben, die nach dem Verzehr gewonnen wurden, stieg die „antioxidative Kraft“, gemessen mit dem FRAP-Assay, während des Verzehrzeitraums an und stieg sogar noch weiter an und erreichte nach der Auswaschphase einen signifikanten Anstieg von 8 %. Die Verringerung des oxidativen Stresses im Serum kann das Ergebnis der Verringerung der Serumlipidkonzentrationen sein (weniger für die Oxidation verfügbares Substrat sowie die Wirkung von starken Antioxidantien im Marula-Saft).

Die Wirkung des Konsums pasteurisierter Säfte auf den oxidativen Stress im Serum ist in zusammengefasst FIG. 14A-B. Serumproben wurden einer AAPH-induzierten Oxidation unterzogen. Lipidperoxidbildung (FEIGE. 14A) war in Serumproben, die nach dem Verzehr des Saftes über einen Zeitraum von 3 Wochen entnommen wurden, signifikant (p < 0,03) verringert. Dieser Effekt hielt nach der Auswaschphase nicht an. Die antioxidative Leistungskapazität, gemessen mit dem FRAP-Assay (FEIGE. 14B), stieg in Serumproben an, die nach dem Verzehr von pasteurisiertem Marula-Saft gewonnen wurden, und stieg überraschenderweise noch weiter an und erreichte eine signifikante Erhöhung von 8 % nach der Auswaschperiode.