Wykaz gatunków Sclerocarya birrea (US84450B2)

Niniejszy wynalazek ogólnie dotyczy rozpuszczalnych w wodzie ekstraktów otrzymanych z Sclerocarya birrea owoce i ich zastosowania.

Marula (Sclerocarya birrea, Rodzina: Anacardiaceae) to średniej wielkości drzewo liściaste o wyprostowanym pniu i zaokrąglonej koronie. Roślina jest dziś wykorzystywana jako źródło pożywienia, podobnie jak w starożytności. Owoce maruli są jadalne, zwykle spożywane na surowo lub przetwarzane na różne produkty spożywcze, takie jak galaretki, a także warzone na piwo alkoholowe, znane ludowi Vhavenda jako Mukumbi.

Zastosowania lecznicze i zastosowania maruli obejmują zastosowanie kory i liści do leczenia chorób bakteryjnych i cukrzycy [1,2], a także biegunki, jak ujawniono w australijskiej publikacji patentowej nr. 2000/29790 [3].

Międzynarodowa publikacja nr. WO 03/092634 [4] ujawnia zastosowanie olejku marula w preparatach do stosowania miejscowego do hamowania powstawania tkanki bliznowatej na skórze.

Wykazano, że owoc Marula ma zwiększoną całkowitą zdolność antyoksydacyjną [5], zdolność hamowania peroksydacji fosfolipidów oraz zdolność wychwytywania anionów ponadtlenkowych [6]. Międzynarodowa publikacja nr. WO 06/097806 [7] ujawnia, że ​​różne części rośliny marula, takie jak kora, liście, owoce, korzenie i nasiona, zawierają przeciwutleniacze hydrofobowe, które można uzyskać z rośliny za pomocą maceracji i/lub ekstrakcji.

Publikacje

Chociaż donoszono, że owoc marula jest bogaty w przeciwutleniacze, jak dotąd nie opisano wytwarzania i stosowania ekstraktów z owocu maruli w leczeniu chorób i zaburzeń, takich jak miażdżyca tętnic i choroby neurodegeneracyjne.

Ujawnione tu zaskakujące wyniki wskazują, że ekstrakty przygotowane z soku z maruli są nie tylko stabilne przez długi czas, ale co ważniejsze, mają inne korzyści terapeutyczne, aw niektórych przypadkach lepsze niż te, które wykazuje nietraktowany sok z maruli. Wykazano, że ekstrakty według wynalazku korzystnie wpływają na lipidy we krwi, na co wskazuje zmniejszenie LDL w surowicy, wzrost HDL w surowicy i osłabienie stresu oksydacyjnego w surowicy; ekstrakty wykazały skuteczność w leczeniu uszkodzeń spowodowanych stresem oksydacyjnym, miażdżycy, neurodegeneracji i zaburzeń z nimi związanych.

Ekstrakty z soku marula według niniejszego wynalazku są również skuteczne w zapobieganiu neurodegeneracji, o czym świadczy ich ochronny wpływ na komórki nerwowe narażone na uszkodzenia spowodowane przez wolne rodniki.

Niniejszy wynalazek ujawnia również zastosowanie ekstraktów z soku marula jako przeciwutleniaczy do stosowania w wielu różnych zastosowaniach, np. zastosowanie w suplementach diety do wywoływania, np. efektu przeciwmiażdżycowego u zdrowych i niezdrowych osobników (ludzi i ludzkie zwierzęta) oraz jako środki do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z neurodegeneracją.

Tak więc, w jednym aspekcie niniejszego wynalazku, dostarczany jest ekstrakt pochodzący z owocu marula, z wyłączeniem nasion, przy czym wspomniany ekstrakt jest otrzymywany w procesie obejmującym poddanie soku zebranego z owocu marula ekstrakcji jednym lub większą liczbą wodnych roztworu, rozpuszczalnika organicznego i ich mieszaniny, tj. w celu uzyskania w ten sposób z soku marula ekstraktu mającego pożądane korzyści biologiczne.

Sok marula uzyskany z owoców maruli można przed ekstrakcją przefiltrować w celu usunięcia resztek owoców, takich jak resztki nasion i inne nierozpuszczalne substancje. Filtrację można przeprowadzić stosując dowolny znany w stanie techniki sposób filtrowania napojów, taki jak między innymi filtracja ziemią okrzemkową (DE) i filtracja membranowa.

W niektórych przykładach wykonania sok marula otrzymany z owoców maruli pasteryzuje się przed ekstrakcją w celu spowolnienia wzrostu drobnoustrojów w soku poprzez zmniejszenie liczby żywotnych patogenów. Zazwyczaj pasteryzację przeprowadzano poprzez wystawienie soku na działanie temperatur poniżej wrzenia. W niektórych wykonaniach pasteryzację uzyskuje się za pomocą jednego lub większej liczby innych sposobów pasteryzacji znanych w stanie techniki, np. kontrolowanych przez krajowe agencje ds. bezpieczeństwa żywności (takie jak USDA w Stanach Zjednoczonych i Food Standards Agency w Wielkiej Brytanii). Niektóre nieograniczające przykłady obejmują pasteryzację w wysokiej temperaturze/krótkim czasie (HTST), pasteryzację o przedłużonym okresie przydatności do spożycia (ESL), pasteryzację w ultrawysokiej temperaturze (UHT lub obróbkę ultracieplną) oraz pasteryzację wsadową lub kadziową.

Stosowane tu określenie „ekstrakt” odnosi się do rozpuszczalnego w wodzie produktu otrzymanego z dowolnej części owocu marula lub jakiejkolwiek części z niego uzyskanej, z wyłączeniem nasion, ale obejmującej jeden lub więcej spośród mezokarpu, endokarpu, skórki (gruba skórka zewnętrzna), i/lub skórki (egzokarp), przez zastosowanie metody wybranej spośród ekspresji, absorpcji, maceracji, liofilizacji, destylacji i dowolnej kombinacji dwóch lub większej liczby tych procesów.

Wyekstrahowane substancje, oddzielnie lub w połączeniu, można formować w dowolny pożądany preparat, w tym roztwór wodny, substancję stałą, taką jak suchy proszek, granulki lub pastylki, koncentrat, np. można uzyskać przez odparowanie całej lub prawie całej płynnej zawartości ekstraktu lub w dowolnej innej postaci. Ogólnie rzecz biorąc, metody ekstrakcji materiału mogą się różnić mutatis mutandis w zależności od wieku owocu marula, podtypu, pory zbioru, regionu wzrostu, substancji, które mają być ekstrahowane, ich trwałości i innych czynników znanych fachowcom.

W niektórych przykładach wykonania ekstrakt według wynalazku otrzymuje się przez kontaktowanie soku marula z wodnym roztworem w celu ekstrakcji z niego jednego lub większej liczby składników lub ich kombinacji. „Roztworem wodnym” może być w najbardziej ogólny sposób woda (w niektórych postaciach woda o różnym naturalnym stężeniu składników mineralnych) lub woda destylowana lub oczyszczona w inny sposób (destylowana lub oczyszczona dowolnym innym sposobem), wodny roztwór soli zawierający jedną lub więcej soli lub mieszanina wody z jednym lub kilkoma mieszającymi się z wodą polarnymi rozpuszczalnikami, np₁-C₄ alkohole i ketony.

W niektórych przykładach wykonania wodny rozpuszczalnik jest mieszaniną wody i co najmniej jednego alkoholu. W niektórych dalszych przykładach wykonania wodnym rozpuszczalnikiem jest mieszanina wody i etanolu, w której stosunek woda:etanol wynosi 1:1, 1:2. . . 1:5 . . . 1:10 . . . 1:100 . . . 1:1000 . . . itd. lub odpowiednio 2:1, 3:1 . . . 5:1 . . . 10:1 . . . 100:1 . . . odpowiednio 1000:1 itd. Każdy inny stosunek pośredni jest również uwzględniony.

Ekstrakcja może alternatywnie wykorzystywać rozpuszczalnik organiczny sam lub w połączeniu z innym takim rozpuszczalnikiem. W niektórych postaciach proces ekstrakcji jest procesem wieloetapowym, w którym owoc marula (sok) kontaktuje się najpierw z jednym rozpuszczalnikiem, a następnie z innym rozpuszczalnikiem, tak aby zmaksymalizować wydajność lub wzbogacić ekstrakt o jeden lub więcej pożądanych składników.

Zazwyczaj rozpuszczalnikiem organicznym jest co najmniej jeden alkohol, taki jak metanol, etanol i alkohol izopropylowy, lub keton, taki jak aceton. Gdy stosuje się etanol, można go stosować w postaci wodnego roztworu etanolowego, np. zawierającego od około 40 do 60% etanolu. Podobne roztwory można również stosować z innymi rozpuszczalnikami organicznymi mieszającymi się z wodą. Ekstrakt otrzymany z ekstraktu alkoholowego jest tutaj oznaczony jako ekstrakt I.

W kontekście niniejszego wynalazku należy rozumieć, że ekstrakcję etanolem lub jakąkolwiek inną ujawnioną tu ekstrakcję można prowadzić w dowolnej dogodnej temperaturze. Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że bardziej wydajna ekstrakcja nastąpi, jeśli sok będzie mieszany, na przykład przez mieszanie lub wstrząsanie, i/lub jeśli mieszaninę ogrzeje się do temperatury powyżej temperatury pokojowej (powyżej 25-27°C). .). Można również stosować niższe temperatury ekstrakcji, takie jak poniżej temperatury pokojowej. W niektórych postaciach proces ekstrakcji prowadzi się w temperaturze pokojowej lub w temperaturze między 25 a 30°C.

Należy również rozumieć w kontekście niniejszego wynalazku, że ekstrakcję można prowadzić przez dowolny dogodny okres czasu.

Specjalista w tej dziedzinie zauważy ponadto, że sposób otrzymywania ekstraktu według wynalazku może obejmować macerowanie owocu marula w celu uzyskania mniejszych kawałków całego owocu, z których ekstrakty można uzyskać za pomocą jednej lub więcej innych metod ekstrakcji, takich jak destylacja. Alternatywnie, ekstrakt można otrzymać przez wyciskanie, mianowicie przez wyciskanie soku z owoców.

Tak więc, w niektórych przykładach wykonania, przed kontaktowaniem soku z jednym lub większą liczbą ujawnionych rozpuszczalników, owoc, tj. cały owoc, z wyłączeniem nasion lub dowolnej jego części, można poddać wstępnej obróbce przez macerację, wyciskanie lub dowolny inny proces.

Sok uzyskany z owoców maruli może być przechowywany przed ekstrakcją lub wstępną obróbką, np. suszeniem, przez dłuższy czas. Przechowywanie może odbywać się w dowolnej temperaturze i warunkach, w których zachowana jest świeżość soku i zapobiega się lub minimalizuje degradację. Takie temperatury mogą być wyższe lub niższe od temperatury pokojowej. W niektórych przykładach wykonania sok można przechowywać w lodówce przez kilka tygodni lub w zamrażarce przez kilka lat. Gdy stosuje się zamrażanie soku, sposób może ponadto obejmować etap rozmrażania soku przed ekstrakcją lub przetwarzaniem.

Suszenie soku można osiągnąć przez ogrzewanie płynnego soku pod próżnią lub pod ciśnieniem atmosferycznym do ustalonej temperatury, która może być temperaturą pokojową lub wyższą niż temperatura otoczenia, w jednej partii lub w mniejszych ilościach, tak aby kontrolować zawartość wilgoci w soku ekstrakt. W ujawnionym tu nieograniczającym przykładzie suszenie uzyskuje się przez wylewanie soku na powierzchnię, taką jak taca, w niektórych przypadkach pokrytą folią (np. folią aluminiową) w celu równomiernego ogrzania soku i uzyskania zasadniczo jednolitej warstwy suszonego ekstraktu z maruli.

Wilgotny koncentrat (syrop) uzyskany w wyniku suszenia ma kolor od żółtawego do ciemnobrązowego, w zależności od stężenia i rodzaju ekstraktu. Wysuszony materiał jest łatwo sproszkowany i ma barwę od jasnozłotej do ciemnobrązowej, w zależności od rodzaju ekstraktu. Suszona masa jest rozpuszczalna w wodzie.

Otrzymywany następnie ekstrakt z maruli zawiera różne ilości substancji lotnych, przy czym ilości te zależą od długości okresu suszenia i zastosowanej temperatury. Bez chęci wiązania się teorią, po usunięciu składników lotnych koncentrat, a mianowicie w niektórych przykładach wykonania sproszkowany ekstrakt, zawiera w porównaniu z całym sokiem owocowym wyższe stężenie składników aktywnych, których obecność i połączenie zapewnia wysoką aktywność, która nie obserwuje się w całym owocu i co zostało tu wykazane.

Zatem ekstrakt otrzymuje się w procesie obejmującym kontaktowanie soku marula z wodnym rozpuszczalnikiem, jak zdefiniowano, w celu uzyskania zawiesiny, z której można oddzielić ciekły ekstrakt.

W niektórych przykładach wykonania proces obejmuje:

W niektórych przykładach wykonania zebrany sok suszy się lub poddaje obróbce wstępnej, jak ujawniono, przed ekstrakcją.

W dalszych przykładach wykonania, oddzielenie płynnego ekstraktu z etapu (iii) może polegać na odwirowaniu zawiesiny otrzymanej w etapie (ii) w celu oddzielenia płynnego ekstraktu jako supernatantu od stałej masy.

W niektórych dalszych przykładach wykonania proces obejmuje:

W dalszych przykładach wykonania proces obejmuje:

W niektórych innych przykładach wykonania proces obejmuje:

Należy zauważyć, że rozdzielanie płynnego ekstraktu można powtarzać więcej niż jeden raz, stosując drugą ilość tego samego lub innego rozpuszczalnika, a supernatanty otrzymane z każdego etapu można łączyć i poddawać dalszej obróbce w celu wyodrębnienia, zatężenia lub dalszej obróbki wyciąg. W ten sposób można połączyć dwa lub więcej supernatantów i usunąć rozpuszczalnik i/lub część wody, na przykład stosując dowolny sposób usuwania rozpuszczalnika.

Gdy wyjściowy materiał owocowy zawiera substancję stałą lub w przypadkach, gdy owoc marula został przetworzony na suszony lub półsuszony proszek lub granulat, ekstrakt można podzielić co najmniej na fazę stałą i fazę wodną, ​​przy czym każda faza zawiera aktywność biologiczna, jak tu ujawniono.

Ekstrakt według wynalazku, otrzymany przez zastosowanie jednego lub większej liczby ujawnionych tu procesów, może charakteryzować się jednym lub większą liczbą z poniższych:

Zatem wynalazek dostarcza również ekstraktu z maruli charakteryzującego się zdolnością przeciwutleniającą FRAP wynoszącą co najmniej 1000 i 1500 mg równoważników witaminy C na 100 ml. Można to porównać do FRAP zmierzonego dla nietraktowanego soku marula, który wynosi od 260 do 600 mg witaminy C na 100 ml. innymi słowy, zdolność FRAP ekstraktu według wynalazku jest między 2- a 3-krotna w stosunku do aktywności obserwowanej w pierwotnym nietraktowanym soku.

W niektórych przykładach wykonania ekstraktem mającym powyższą zdolność FRAP jest ekstrakt I.

Niniejszy wynalazek dostarcza także ekstraktu zawierającego frakcję zubożonych polifenoli, przy czym ten ekstrakt jest tutaj oznaczony jako ekstrakt II. Frakcja polifenolowa, tutaj jako ekstrakt III, może być oddzielona od soku marula np. przez chromatografię soku marula w celu uzyskania ekstraktu II (zubożony) i ekstraktu III (oddzielona frakcja fenolowa). W niektórych postaciach zubożenie frakcji polifenolowej uzyskuje się w procesie obejmującym filtrowanie soku marula, na przykład przez przepuszczanie soku przez jedną lub więcej warstw gazy (o różnych stopniach, np. jakość i ilość soku), opcjonalnie odwirowanie przefiltrowanego soku w celu usunięcia osadów owocowych, naniesienie klarownego soku na chromatografię, np.₁₈-związana krzemionka lub żywice do oddziaływań hydrofobowych i chromatografii z odwróconymi fazami, zbieranie frakcji i łączenie frakcji o tej samej całkowitej zawartości rozpuszczalnych substancji stałych (TSS).

W niektórych przykładach wykonania frakcję polifenolową można zebrać z pożywki stosowanej do chromatografii, np. z perełek kolumny, przez zmieszanie pożywki, np. perełek, z roztworem alkoholowym (etanol, metanol itp.). Frakcje alkoholowe można następnie połączyć i odparować do sucha.

Według niektórych przykładów wykonania, w celu uzyskania ekstraktu o zwiększonym stosunku polifenole:witamina C, frakcję polifenolową (tj. ekstrakt III) można oddzielić od soku, a następnie dodać do frakcji zubożonej w polifenole (tj. ekstrakt II) . W niektórych innych przykładach wykonania ekstrakt II łączy się z ekstraktem I.

W niektórych przykładach wykonania ekstrakt II charakteryzuje się zdolnością przeciwutleniającą FRAP wynoszącą co najmniej od 250 do 500 mg równoważników witaminy C na 100 ml.

Stosowane tu określenie „polifenole” odnosi się do grupy substancji charakteryzujących się obecnością więcej niż jednej jednostki fenolowej lub elementu budulcowego na cząsteczkę. Polifenole są generalnie podzielone na garbniki ulegające hydrolizie (estry kwasu galusowego z glukozą i innymi cukrami) oraz fenylopropanoidy, takie jak ligniny, flawonoidy i taniny skondensowane. W niektórych przykładach wykonania polifenole otrzymane z soku z plamki żółtej obejmują ulegające hydrolizie garbniki, katechiny i kwasy hydroksycynamonowe i/lub ich pochodne.

W innym swoim aspekcie niniejszy wynalazek zapewnia zastosowanie co najmniej jednego ekstraktu według wynalazku do wytwarzania kompozycji.

W niektórych przykładach wykonania kompozycja jest kompozycją farmaceutyczną.

W dalszych postaciach ekstrakt jest składnikiem aktywnym obecnym w kompozycji wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

Wybór nośnika będzie częściowo określony przez konkretny ekstrakt, jak również przez konkretny sposób podawania zawierającej go kompozycji. W związku z tym istnieje wiele różnych odpowiednich preparatów kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku. Następujące preparaty do podawania doustnego, aerozolowego, pozajelitowego, podskórnego, dożylnego, domięśniowego, dootrzewnowego, doodbytniczego i dopochwowego są jedynie przykładowe iw żaden sposób nie ograniczają.

Preparaty odpowiednie do podawania doustnego mogą składać się z (a) płynnych roztworów, takich jak skuteczna ilość ekstraktu rozpuszczona w rozcieńczalnikach, takich jak woda, sól fizjologiczna lub sok pomarańczowy; (b) kapsułki, saszetki, tabletki, pastylki do ssania i kołaczyki, z których każda zawiera określoną ilość ekstraktu, w postaci substancji stałych lub granulek; c) proszki; d) zawiesiny w odpowiednim płynie; oraz (e) odpowiednie emulsje. Ciekłe preparaty mogą zawierać rozcieńczalniki, takie jak woda i alkohole, na przykład etanol, alkohol benzylowy i alkohole polietylenowe, z dodatkiem lub bez dodatku farmaceutycznie dopuszczalnego środka powierzchniowo czynnego, środka zawieszającego lub środka emulgującego. Postacie kapsułek mogą być typu zwykłej żelatyny o twardej lub miękkiej otoczce, zawierającej na przykład środki powierzchniowo czynne, środki poślizgowe i obojętne wypełniacze, takie jak laktoza, sacharoza, fosforan wapnia i skrobia kukurydziana. Formy tabletek mogą zawierać jedną lub więcej spośród laktozy, sacharozy, mannitolu, skrobi kukurydzianej, skrobi ziemniaczanej, kwasu alginowego, celulozy mikrokrystalicznej, gumy arabskiej, żelatyny, gumy guar, koloidalnego dwutlenku krzemu, kroskarmelozy sodowej, talku, stearynianu magnezu, stearynianu wapnia, stearynianu cynku , kwas stearynowy i inne zaróbki, barwniki, rozcieńczalniki, środki buforujące, środki rozsadzające, środki zwilżające, konserwanty, środki smakowe i farmakologicznie kompatybilne nośniki. Postacie pastylek do ssania mogą zawierać substancję czynną w środku smakowym, zwykle sacharozę i gumę arabską lub tragakantową, jak również pastylki zawierające substancję czynną w obojętnym podłożu, takim jak żelatyna i gliceryna lub sacharoza i guma arabska, emulsje, żele i tym podobne zawierające , oprócz ekstraktu, takie nośniki, jakie są znane w stanie techniki.

Ekstrakty lub kompozycje według niniejszego wynalazku, np. kompozycja farmaceutyczna, same lub w połączeniu z innymi odpowiednimi składnikami, można przekształcić w preparaty aerozolowe do podawania przez inhalację. Te preparaty aerozolowe można umieszczać w dopuszczalnych propelentach pod ciśnieniem, takich jak dichlorodifluorometan, propan, azot i tym podobne. Można je również formułować jako farmaceutyki do preparatów bezciśnieniowych, takich jak nebulizator lub rozpylacz.

Preparaty odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne, izotoniczne sterylne roztwory do iniekcji, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, które nadają preparatowi izotoniczność z krwią zamierzonego biorcy, oraz wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które obejmują środki zawieszające, solubilizatory, środki zagęszczające, stabilizatory i konserwanty. Związek można podawać w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku w farmaceutycznym nośniku, takim jak sterylna ciecz lub mieszanina cieczy, w tym woda, sól fizjologiczna, wodne roztwory dekstrozy i pokrewnych cukrów, alkohol, taki jak etanol, izopropanol lub alkohol heksadecylowy, glikole, takie jak glikol propylenowy lub glikol polietylenowy, ketale glicerolu, takie jak 2,2-dimetylo-1,3-dioksolano-4-metanol, etery, takie jak poli(etylenoglikol) 400, olej, kwas tłuszczowy, kwas tłuszczowy ester kwasowy lub gliceryd, lub gliceryd acetylowanego kwasu tłuszczowego z dodatkiem lub bez dodatku farmaceutycznie dopuszczalnego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak mydło lub detergent, środka zawieszającego, takiego jak pektyna, karbomery, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza lub karboksymetyloceluloza, lub środków emulgujących i inne adiuwanty farmaceutyczne.

Oleje, które można stosować w preparatach pozajelitowych, obejmują oleje naftowe, oleje zwierzęce, roślinne lub syntetyczne. Konkretne przykłady olejów obejmują olej arachidowy, sojowy, sezamowy, bawełniany, kukurydziany, oliwkowy, wazelinę i mineralny. Odpowiednie kwasy tłuszczowe do stosowania w preparatach pozajelitowych obejmują kwas oleinowy, kwas stearynowy i kwas izostearynowy. Przykładami odpowiednich estrów kwasów tłuszczowych są oleinian etylu i mirystynian izopropylu. Odpowiednie mydła do stosowania w preparatach pozajelitowych obejmują sole tłuszczowych metali alkalicznych, amonowe i trietanoloaminowe, a odpowiednie detergenty obejmują (a) detergenty kationowe, takie jak na przykład halogenki dimetylodialkiloamoniowe i halogenki alkilopirydyniowe, (b) detergenty anionowe, takie jak na przykład siarczany alkilu, arylu i olefin, siarczany alkilu, olefin, eterów i monoglicerydów oraz sulfobursztyniany, (c) detergenty niejonowe, takie jak na przykład tlenki amin tłuszczowych, alkanoloamidy kwasów tłuszczowych i kopolimery polioksyetylenopolipropylenowe, (d) amfoteryczne detergenty, takie jak na przykład alkilo-β-aminopriopioniany i czwartorzędowe sole amoniowe 2-alkiloimidazoliny oraz (3) ich mieszaniny.

Preparaty pozajelitowe zazwyczaj zawierają od około 0,5 do około 25% wagowych ekstraktu w roztworze. W takich preparatach można stosować odpowiednie środki konserwujące i bufory. W celu zminimalizowania lub wyeliminowania podrażnienia w miejscu wstrzyknięcia, takie kompozycje mogą zawierać jeden lub więcej niejonowych środków powierzchniowo czynnych o równowadze hydrofilowo-lipofilowej (HLB) od około 12 do około 17. Ilość środka powierzchniowo czynnego w takich preparatach waha się od około 5 do około 15% wagowych. Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują polietylenosorbitanowe estry kwasów tłuszczowych, takie jak monooleinian sorbitanu i addukty tlenku etylenu o dużej masie cząsteczkowej z hydrofobową zasadą, utworzone przez kondensację tlenku propylenu z glikolem propylenowym. Preparaty do podawania pozajelitowego mogą być dostarczane w szczelnie zamkniętych pojemnikach jednodawkowych lub wielodawkowych, takich jak ampułki i fiolki, i mogą być przechowywane w stanie liofilizowanym (liofilizowanym), wymagającym jedynie dodania sterylnego płynnego nośnika, na przykład wody , do wstrzykiwań, bezpośrednio przed użyciem. Roztwory i zawiesiny do wstrzykiwań doraźnych można wytworzyć ze sterylnych proszków, granulek i tabletek rodzaju opisanego powyżej.

Z ekstraktów i kompozycji według niniejszego wynalazku można wytwarzać preparaty do wstrzykiwania. Wymagania dotyczące skutecznych nośników farmaceutycznych dla kompozycji do wstrzykiwania są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Widzieć Farmacja i Praktyka Farmaceutyczna, J. B. Lippincott Co., Filadelfia, Pensylwania, Banker i Chalmers, red., strony 238-250 (1982) oraz Podręcznik ASHP dotyczący leków iniekcyjnych, W innym, 4^cz wyd., strony 622-630 (1986).

Dodatkowo, z ekstraktów według niniejszego wynalazku można sporządzić czopki przez zmieszanie z różnymi podłożami, takimi jak podłoża emulgujące lub podłoża rozpuszczalne w wodzie. Preparaty odpowiednie do podawania dopochwowego mogą mieć postać globulek, tamponów, kremów, żeli, past, pianek lub preparatów w sprayu zawierających, oprócz składnika aktywnego, takie nośniki, jakie są znane w stanie techniki jako odpowiednie.

Jak stwierdzono powyżej, ekstrakty i kompozycje według wynalazku można wytwarzać, prezentować i/lub przechowywać w dowolnej postaci, a mianowicie w postaci cieczy, koncentratu, suchego proszku, roztworu, emulsji lub roztworu podstawowego lub koncentrat zapasowy.

W niektórych przykładach wykonania kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do leczenia lub zapobiegania co najmniej jednej chorobie lub zaburzeniu związanemu z uszkodzeniami wywołanymi stresem oksydacyjnym.

Stres oksydacyjny jest wynikiem braku równowagi w homeostazie prooksydacyjnej/przeciwutleniającej, co prowadzi do powstawania toksycznych reaktywnych form tlenu. Wolne rodniki powstają, gdy tlen oddziałuje z pewnymi cząsteczkami i rozpoczyna reakcję łańcuchową uszkodzeń między ważnymi składnikami komórkowymi. Zatem stan zapalny i procesy oksydacyjne są ze sobą powiązane. Ponadto stres oksydacyjny może indukować cytotoksyczność komórek krwi, stymulować uwalnianie cytokin zapalnych i indukować produkcję czynników wzrostu. Stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w tworzeniu blaszek miażdżycowych i wraz z nieodłącznym zapaleniem naczyń może być silnym predyktorem miażdżycy.

Tak więc, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, „uszkodzenie spowodowane stresem oksydacyjnym” odnosi się do uszkodzenia komórek, tkanek i/lub narządów zwierzęcia, w tym człowieka, które jest spowodowane brakiem równowagi między wytwarzaniem reaktywnego tlenu a zdolnością układu biologicznego do łatwego detoksykacji reaktywnych półproduktów lub łatwej naprawy powstałych uszkodzeń. Najczęściej zaburzenia tego normalnego stanu redoks mogą powodować efekty toksyczne poprzez produkcję nadtlenków i wolnych rodników, które uszkadzają wszystkie lub niektóre składniki komórki, w tym białka, lipidy i DNA.

W niektórych postaciach uszkodzenie spowodowane stresem oksydacyjnym jest związane z zaburzeniem lub chorobą wybraną spośród miażdżycy tętnic, choroby Parkinsona, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, chorób lub zaburzeń neurodegeneracyjnych, chorób oczu, zespołu chronicznego zmęczenia i innych.

Miażdżyca tętnic, główna przyczyna zachorowalności i umieralności wśród osób o zachodnim stylu życia, rozwija się w wyniku działania różnych czynników ryzyka. Hipercholesterolemia jest głównym czynnikiem ryzyka miażdżycy tętnic, a obniżenie stężenia cholesterolu w osoczu poprzez farmakoterapię zmniejsza częstość występowania chorób sercowo-naczyniowych. Zmiana miażdżycowa charakteryzuje się przyspieszonym stresem oksydacyjnym i powstawaniem reaktywnych form tlenu (ROS), które atakują lipidy w lipoproteinach, a także w makrofagach tętniczych. Oksydacyjna modyfikacja lipoprotein o małej gęstości (LDL) odgrywa kluczową rolę w patogenezie miażdżycy. Utleniony LDL (Ox-LDL) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju zmian miażdżycowych, ponieważ stymuluje gromadzenie się cholesterolu w makrofagach i tworzenie komórek piankowatych. W przeciwieństwie do aterogenności LDL, poziomy lipoprotein o dużej gęstości (HDL) w surowicy są odwrotnie proporcjonalne do ryzyka miażdżycy. HDL wywiera hamujący wpływ na utlenianie LDL, a efekt ten może być związany z towarzyszącym mu enzymem paraoksonazą 1 (PON1).

Miażdżyca tętnic jest również procesem lub zaburzeniem polegającym na gromadzeniu się blaszki miażdżycowej na wewnętrznej stronie tętnic, w tym w sercu, mózgu, ramionach, nogach i miednicy. Tak więc termin ten może również odnosić się do postępującej akumulacji komórek mięśni gładkich, komórek odpornościowych (np. limfocytów, makrofagów lub monocytów), produktów lipidowych (np. wewnętrznej wyściółki tętnicy, powodując zwężenie lub niedrożność naczynia krwionośnego i rozwój chorób związanych z miażdżycą tętnic.

Ponieważ miażdżyca objawia się w obrębie dużych i średnich tętnic, leczenie lub profilaktyka często wpływa na rozwój stanu przewlekłego stanu zapalnego w obrębie tętnic.

Ekstrakt według wynalazku jest zatem odpowiedni również do leczenia i zapobiegania stanom obejmującym miażdżycę tętnic wieńcowych, powodującą chorobę wieńcową, zawał mięśnia sercowego, zakrzepicę naczyń wieńcowych i dusznicę bolesną; miażdżyca tętnic zaopatrujących ośrodkowy układ nerwowy powodująca udary i przemijające niedokrwienie mózgu; miażdżyca krążenia obwodowego powodująca chromanie przestankowe i gangrenę; miażdżyca tętnicy krążenia trzewnego powodująca niedokrwienie krezki; i zwężenie tętnicy nerkowej.

Tak więc, kompozycja według wynalazku jest ponadto odpowiednia do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu co najmniej jednej chorobie lub zaburzeniu związanemu z jednym lub więcej ze zwiększonych stężeń triglicerydów lipidowych w surowicy, stężeń cholesterolu w surowicy i stężeń cholesterolu całkowitego i LDL w surowicy oraz zmniejszonego HDL- stężenia cholesterolu.

W niniejszym opisie taka choroba lub zaburzenie związane ze zwiększonymi stężeniami triglicerydów lipidowych w surowicy, stężeniami cholesterolu w surowicy i stężeniami cholesterolu całkowitego i LDL w surowicy oraz zmniejszonymi stężeniami cholesterolu HDL, obejmuje nienormalnie wysokie poziomy cholesterolu (hipercholesterolemia) i/lub wysokie poziomy LDL lub triglicerydów i/lub niższych stężeń funkcjonalnego HDL, takich jak choroba niedokrwienna serca lub inne postacie chorób sercowo-naczyniowych, jak również choroby lub zaburzenia, które obejmują rozwój miażdżycy w tętnicach (tj. miażdżyca tętnic), takie jak hipocholesterolemia, choroba naczyń obwodowych, cukrzyca i wysokie ciśnienie krwi.

Stres oksydacyjny został również powiązany ze śmiercią komórek nerwowych, która jest związana z różnymi stanami neurodegeneracyjnymi. Choroby neurodegeneracyjne to stany, w których dochodzi do utraty komórek mózgu i rdzenia kręgowego. Zwykle neurodegeneracja zaczyna się na długo przed wystąpieniem jakichkolwiek objawów. Ponieważ komórki mózgowe są stale narażone na reaktywne formy tlenu wytwarzane przez metabolizm oksydacyjny, stres oksydacyjny jest również jednym z czynników predysponujących do zaburzeń neurologicznych u dorosłych i jest zaangażowany w patogenezę niektórych z tych zaburzeń, takich jak choroba Parkinsona.

Ekstrakt lub kompozycja według wynalazku jest również stosowana do leczenia lub zapobiegania co najmniej jednej chorobie lub zaburzeniu związanemu z neurodegeneracją.

„Choroby lub zaburzenia neurodegeneracyjne” w kontekście niniejszego wynalazku odnoszą się do jednego lub większej liczby stanów, w których komórki mózgu i rdzenia kręgowego są tracone w wyniku degradacji neuronów lub ich osłonki mielinowej, co z czasem prowadzi do dysfunkcji i wynikających z tego niepełnosprawności. Tak więc, choroby lub zaburzenia neurodegeneracyjne są związane ze stanami powodującymi problemy z poruszaniem się, takimi jak ataksja, a także ze stanami wpływającymi na pamięć i związanymi z demencją. Niektóre nieograniczające przykłady chorób lub zaburzeń neurodegeneracyjnych obejmują alkoholizm, chorobę Alexandra, chorobę Alpera, chorobę Alzheimera, stwardnienie zanikowe boczne (choroba Lou Gehriga), ataksję teleangiektazyjną, chorobę Battena (znaną również jako choroba Spielmeyera-Vogta-Sjögrena-Battena), gąbczasta encefalopatia bydła (BSE), choroba Canavan, porażenie mózgowe, zespół cockayne'a, zwyrodnienie korowo-podstawne, choroba Creutzfeldta-Jakoba, zwyrodnienie płata czołowo-skroniowego, choroba Huntingtona, otępienie związane z HIV, choroba Kennedy'ego, choroba Krabbego, otępienie z ciałami Lewy'ego, neuroborelioza, choroba Machado- choroba Josepha (ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 3), zanik wielonarządowy, stwardnienie rozsiane, narkolepsja, choroba Niemanna-Picka, choroba Parkinsona, choroba Pelizaeusa-Merzbachera, choroba Picka, pierwotne stwardnienie boczne, choroby prionowe, postępujące porażenie nadjądrowe, choroba Refsuma, choroba Sandhoffa, choroba dziecka, podostre złożone zwyrodnienie rdzenia kręgowego wtórne do niedokrwistości złośliwej, ataksja rdzeniowo-móżdżkowa, rdzeniowy zanik mięśni, choroba Steele'a-Richardsona-Olszewskiego i tabes dorsalis.

W jeszcze innym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza sposób leczenia lub zapobiegania co najmniej jednej chorobie lub zaburzeniu związanemu z uszkodzeniem wywołanym stresem oksydacyjnym u ssaka, obejmujący podawanie temu ssakowi skutecznej ilości ekstraktu według wynalazku lub zawierającą je kompozycję farmaceutyczną.

W dodatkowym aspekcie niniejszego wynalazku dostarcza się sposób leczenia lub zapobiegania co najmniej jednej chorobie lub zaburzeniu związanemu z jednym lub większą liczbą podwyższonych stężeń triglicerydów lipidowych w surowicy, stężeń cholesterolu w surowicy i stężeń cholesterolu całkowitego i LDL w surowicy oraz zmniejszonego HDL - stężenia cholesterolu u ssaka, obejmujące podawanie temu ssakowi skutecznej ilości ekstraktu według wynalazku lub zawierającej go kompozycji farmaceutycznej.

W dalszym jednym ze swoich aspektów niniejszy wynalazek dostarcza sposób leczenia lub zapobiegania co najmniej jednej chorobie lub zaburzeniu związanemu z neurodegeneracją u ssaka, obejmujący podawanie temu ssakowi skutecznej ilości ekstraktu według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej tego.

W jeszcze kolejnym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwutleniacz zawierający ekstrakt według wynalazku.

W jeszcze kolejnym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza środek obniżający cholesterol zawierający ekstrakt według wynalazku.

W zakresie niniejszego wynalazku określenie „leczenie i/lub zapobieganie” odnosi się do podawania terapeutycznej ilości kompozycji według niniejszego wynalazku, która jest skuteczna w łagodzeniu niepożądanych objawów związanych z chorobą, zapobieganiu manifestacji takich objawów przed ich wystąpieniem, aby spowolnić postęp choroby, spowolnić nasilanie się objawów, przyspieszyć początek okresu remisji, spowolnić nieodwracalne szkody spowodowane w postępującym, przewlekłym stadium choroby, aby opóźnić początek wspomnianej stadium progresji, w celu złagodzenia ciężkości lub wyleczenia choroby, poprawy wskaźnika przeżywalności lub szybszego powrotu do zdrowia, lub zapobieżenia wystąpieniu postaci choroby lub kombinacji dwóch lub więcej z powyższych.

Ekstrakt lub kompozycję według wynalazku można podawać dowolnym sposobem znanym specjaliście w dziedzinie. Typowo, podawanie ekstraktu lub zawierającej go kompozycji farmaceutycznej to skuteczna ilość ekstraktu (ekstraktów) zawartych w kompozycji. „Skuteczna ilość” do celów niniejszego dokumentu jest określana na podstawie takich rozważań, jakie mogą być znane w stanie techniki. Ilość musi być skuteczna do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego, jak opisano powyżej, w zależności między innymi od typu i ciężkości leczonej choroby i schematu leczenia. Skuteczną ilość zazwyczaj określa się w odpowiednio zaprojektowanych próbach klinicznych (np. badaniach zakresu dawek), a osoba biegła w dziedzinie będzie wiedziała, jak właściwie przeprowadzić takie próby w celu określenia skutecznej ilości. Jak ogólnie wiadomo, skuteczna ilość zależy od wielu czynników, w tym powinowactwa ligandu do receptora, jego profilu dystrybucji w organizmie, różnych parametrów farmakologicznych, takich jak okres półtrwania w organizmie, niepożądanych skutków ubocznych, jeśli dowolny, od czynników takich jak wiek i płeć itp.

Ekstrakt według wynalazku można również stosować do przygotowania kompozycji do stosowania w różnych zastosowaniach niefarmaceutycznych. W niektórych przykładach wykonania kompozycja jest kompozycją przeciwutleniającą do stosowania jako środek konserwujący do wielu różnych zastosowań w przemyśle spożywczym, przemyśle kosmetycznym, terapeutycznym itp. oraz do hamowania utleniania LDL indukowanego jonami miedzi in vitro lub na żywo.

Ujawniony tutaj ekstrakt może być dodatkowo stosowany jako suplement diety lub jako aktywny składnik takiego suplementu. W niektórych przykładach wykonania suplement jest odpowiedni do spożycia zarówno przez ludzi, jak i zwierzęta inne niż ludzie, do zarządzania dobrym samopoczuciem oraz leczenia i zapobiegania stanom i zaburzeniom związanym z uszkodzeniami oksydacyjnymi.

W kontekście niniejszego wynalazku suplement diety, w zależności od jego charakteru i postaci fizycznej, np. natury lipofilowej lub hydrofilowej, może ponadto zawierać jeden lub więcej emulgatorów, stabilizatorów, przeciwutleniaczy i innych dodatków. Stosuje się emulgatory kompatybilne z żywnością, takie jak fosfolipidy, na przykład lecytyna, mono- lub tristearynian polioksyetylenosorbitanu, monolaurynian, monopalmitynian, mono- lub trioleinian, mono- lub digliceryd. Te emulgatory, stabilizatory, przeciwutleniacze i dodatki można dodawać do ekstraktu według wynalazku zgodnie z końcowym zastosowaniem wspomnianego ekstraktu.

Ujawniony tu suplement odżywczy może również zawierać syntetyczne lub naturalne substancje bioaktywne, takie jak aminokwasy, kwasy tłuszczowe, witaminy, minerały, polifenole itp., które można dodawać do kompozycji na sucho lub na mokro przed pasteryzacją i/lub suszeniem.

W niektórych postaciach suplement diety jest kompletną formułą odżywczą, produktem mleczarskim, schłodzonym lub trwałym napojem, wodą mineralną lub oczyszczoną, płynnym napojem, zupą, suplementem diety, zamiennikiem posiłku, batonem odżywczym, wyroby cukiernicze, mleko lub sfermentowany produkt mleczny, jogurt, proszek na bazie mleka, produkt do żywienia dojelitowego, preparat dla niemowląt, odżywka dla niemowląt, produkt zbożowy lub produkt na bazie fermentowanego zboża, lody, czekolada, kawa, produkt kulinarny, taki jak majonez, przecier pomidorowy lub sosy do sałatek lub karma dla zwierząt domowych. Zgodnie z tymi przykładami wykonania, ekstrakt według wynalazku może być rozproszony w żywności lub napojach tak, aby zapewnić dzienne spożycie bioaktywnych składników odżywczych, które zależy głównie od rodzaju żywności, w której ekstrakt jest rozproszony, pożądanego efektu i tkanki docelowej . Ilość suplementu żywnościowego do spożycia przez osobnika w celu uzyskania korzystnego efektu będzie również zależała od jednego lub większej liczby różnych czynników, takich jak rodzaj suplementu diety i/lub żywności oraz wiek i waga konsumenta.

Suplement diety do podawania doustnego może mieć postać kapsułek, kapsułek żelatynowych, kapsułek miękkich, tabletek, tabletek powlekanych cukrem, pigułek, past lub pastylek, gum lub roztworów lub emulsji do picia, syropu lub żelu, w dawce około 0,1 do 100% ekstraktu według wynalazku, który następnie można przyjmować bezpośrednio z wodą lub w jakikolwiek inny znany sposób. Dodatek ten może również zawierać środek słodzący, stabilizator, przeciwutleniacz, dodatek, środek smakowo-zapachowy lub barwnik.

Należy zauważyć, że pewne cechy wynalazku, które są dla jasności opisane w kontekście oddzielnych przykładów wykonania, mogą być również zapewnione w połączeniu w pojedynczym przykładzie wykonania. I odwrotnie, różne cechy wynalazku, które są dla zwięzłości opisane w kontekście pojedynczego przykładu wykonania, mogą być również dostarczone oddzielnie lub w dowolnej odpowiedniej kombinacji podrzędnej lub jako odpowiednie w dowolnym innym opisanym przykładzie wykonania wynalazku. Pewnych cech opisanych w kontekście różnych przykładów wykonania nie należy uważać za zasadnicze cechy tych przykładów wykonania, chyba że przykład wykonania nie działa bez tych elementów.

Stosowany tu proces, ekstrakt lub kompozycje według wynalazku mogą obejmować dodatkowe etapy lub składniki lub części, tylko jeśli dodatkowe etapy, składniki lub części nie zmieniają podstawowych i nowych właściwości zastrzeganego procesu, ekstraktu i kompozycji. Stosowane tu formy liczby pojedynczej „a”, „an” i „the” obejmują odniesienia do liczby mnogiej, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej.

Różne przykłady wykonania i aspekty niniejszego wynalazku, jak przedstawiono powyżej i jak zastrzeżono w sekcji zastrzeżeń poniżej, znajdują potwierdzenie doświadczalne w poniższych przykładach.

1. Suszenie Soku Marula

Owoce maruli zbierano z gruntu w ciągu 10 dni od opadnięcia z drzew, a następnie wyciskano je prasą hydrauliczną pod ciśnieniem 35 barów (tłocznik do oliwek Enorossi model 250). Sok zbierano i przechowywano zamrożony w -20°C przez różne okresy do 3 lat. Bezpośrednio przed suszeniem sok rozmrażano i rozlewano na tackach z folii aluminiowej, uzyskując jednolitą warstwę o grubości 0,7 cm. Tace zawierające sok umieszczono w piecu próżniowym (Tuttnauer, suchy sterylizator w piecu model 11-900), ustawionym na 57°C i -760 mm rtęci na okres 3 dni. Po wysuszeniu, zawierającym około 1% wilgoci, substancję stałą zmielono, uzyskując proszek, łatwo rozpuszczalny w wodzie. Proszek przechowywano w eksykatorze w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

2. Preparaty z ekstraktem z maruli

A. Ekstrakt etanolowy (określany w niniejszym dokumencie jako „ekstrakt I”)

W celu przygotowania ekstraktu I 15 gramów suszonego soku z maruli rozgnieciono na proszek, zawieszono w 50 ml 50% etanolu i umieszczono na wytrząsarce na 20 min. Zawiesinę odwirowano i supernatant przeniesiono do okrągłej kolby. Etap powtórzono z dodatkowymi 25 ml 50% etanolu. Dwa supernatanty połączono i etanol i część wody usunięto na wyparce obrotowej. Końcowe 30 ml roztworu wodnego miało zdolność przeciwutleniającą FRAP (zdolność antyoksydacyjna zmniejszająca żelazo) równą 1390 mg ekwiwalentu witaminy C na 100 ml (3-krotność zdolności antyoksydacyjnej w porównaniu z 460 mg ekwiwalentu witaminy C na 100 ml zmierzonej w oryginalnym soku) . Ekstrakt I można rozpuścić w wodzie.

B. Frakcja zubożona w polifenole (określana w niniejszym dokumencie jako „ekstrakt II”):

W celu przygotowania ekstraktu II sok z całej maruli przepuszczono przez 8 warstw gazy i odwirowano w celu usunięcia resztek tkanki owocowej. 200 ml klarownego soku naniesiono na 20 ml kolumnę Sepabeads z szybkością przepływu 0,4 ml/min. Zebrano 12 ml frakcje. Frakcje zawierające takie samo całkowite stężenie rozpuszczalnych substancji stałych (TSS) jak klarowny sok (12,9%) połączono. Aktywność przeciwutleniająca FRAP zmierzona w tej frakcji wynosiła 379 mg równoważników witaminy C na 100 ml, w przybliżeniu 83% tej zmierzonej w klarownym soku nałożonym na kolumnę.

C. Frakcja polifenolowa (określana w niniejszym dokumencie jako „ekstrakt III”).

Do przygotowania ekstraktu III zastosowano ekstrakcję okresową w celu uwolnienia polifenoli z opisanych powyżej perełek kolumny. Perełki przeniesiono do kolby szklanej z szerokim dnem i dokładnie zmieszano z 85% roztworem etanolu. Roztwór etanolowy odzyskano i etap powtarzano, aż roztwór ekstrakcyjny był bezbarwny. Zebrane roztwory etanolowe połączono, umieszczono w okrągłej kolbie i odparowano do sucha na wyparce rotacyjnej. Suchą błonę rozpuszczono w 1 ml wody. Otrzymany produkt miał aktywność FRAP równą 5735 mg równoważników witaminy C na 100 ml, co stanowi około 12-krotność aktywności zmierzonej w oryginalnym soku.

W celu otrzymania napoju marula wzbogaconego w polifenole, 15 ml frakcji soku zubożonej w polifenole (ekstrakt II) zmieszano z wyizolowaną frakcją polifenolową (ekstrakt III); wodę dodano do końcowej objętości 25 ml napoju marula (zawierającego opisane tu ekstrakty II i III) o aktywności przeciwutleniającej FRAP wynoszącej 446 mg równoważnika witaminy C na 100 ml, z czego 50% stanowiła witamina C, a 50% przez polifenole, w porównaniu do odpowiednio ~75% i 25% w oryginalnym soku.

Całkowite polifenole oznaczano spektrofotometrycznie metodą Singletona zmodyfikowaną dla małych objętości [Singleton V L i in., Am. J. Emology and Viticulture 16:144-158, 1965]. Jako wzorzec służył kwas galusowy (GA). Roztwór podstawowy GA przygotowano w wodzie w stężeniu 2 mM. Objętości 10, 20, 40 i 60 mikrolitrów zastosowano do krzywej wzorcowej. Wyniki następnie wyrażono jako równoważniki GA (GAE). Czasami pirogalol zastępował GA jako standard.

3. Metody in vitro

FIGA. 1 pokazuje całkowite stężenie polifenoli w każdym z przefiltrowanych soków marula, etanolowego ekstraktu suszonego soku marula (ekstrakt I) i produktu otrzymanego przez połączenie opisanych tu ekstraktów II i III. Całkowite stężenie wynosiło odpowiednio 7,15, 8,34 i 9,35 mg równoważników kwasu galusowego (GAE)/ml.

FIGA. 2 przedstawia chromatogramy HPLC soku i ekstraktów soku marula. Każdy ekstrakt soku przemyto (1:3) 80% metanolem z dodatkiem 2 mM NaF w celu ekstrakcji przeciwutleniaczy. Zawiesinę odwirowano i supernatant przesączono przez filtr 0,45 µm przed wstrzyknięciem. Próbki o objętości 20 μl analizowano przy użyciu systemu LaChrom Merck Hitachi HPLC, składającego się z pompy L7100, pieca kolumnowego L7350 (ustawionego na 28°C), mieszalnika-odgazowywacza L-7614 i wstrzykiwacza ręcznego Rheodyne, połączonego z detektorem wielofalowym (Jasco MD- 2010 Plus), interfejs (Jasco LC-Net II/ADC) i oprogramowanie naukowe (EZChrom Elite Client/Server wersja 3.1.6, kompilacja 3.1.6.2433). Zamknięta na końcach kolumna Purospher®Star RP-18 (wkład LichroCART® 250×4 mm, wielkość cząstek 5 μm) z zamkniętą na końcach kolumna ochronna Lichrospher®100 RP-18 (wkład LichroCART® 4×4 mm, wielkość cząstek 5 μm) ) były użyte.

Końcówkę kolumny podłączono do kolektora frakcji (Pharmacia Fine Chemicals, FRAC-100). Fazy ​​ruchome składały się z (A) kwasu fosforowego (0,1%), pH 2,4 i (B) metanolu; gradient elucji ustawiono na przejście od 0 do 100% metanolu w ciągu 30 minut. Szybkość przepływu wynosiła 0,6 ml min⁻¹.

Stężenie witaminy C oceniano z obszaru pod odpowiednimi pikami chromatogramu, stosując do kalibracji witaminę C klasy HPLC (Fluka). Metanol był czystości do HPLC (LiChrosolv Merck); wodę oczyszczono i przefiltrowano stosując znane procedury; kwas fosforowy (Frutarom) i NaF (Sigma) były czystości analitycznej. Standardowa biblioteka fenoli została skonstruowana przy użyciu katechiny, kwasu chlorogenowego, kawowego i garbnikowego firmy Sigma oraz kwasu 2-hydroksybenzoesowego (salicylowego), 3-β-glukozydu kwercetyny i kwasu elagowego firmy Fluka.

Jak wskazują chromatogramy HPLC, każdy z ekstraktów I, II, III miał unikalny skład pod względem związków fenolowych [kwasy fenolowe (PA) i garbniki (T)] oraz witaminy C. Trzy ekstrakty różniły się istotnie składem przeciwutleniającym w porównaniu z oryginalnym sok.

Zdolność wychwytywania wolnych rodników przez produkty z soku marula była również analizowana za pomocą testu DPPH [Malterud KM, Farbort TL, Huse ACE, Bredo Sund R. Przeciwutleniające i wymiatające rodniki działanie artrachinonów i antoronów. Farmakologia. 1993: 47: 77-85]. DPPH (1,1-difenylo-2-pikryl-hydrazyl) jest substancją generującą wolne rodniki, która jest szeroko stosowana do monitorowania zdolności wychwytywania wolnych rodników (zdolność związku do oddawania elektronu) różnych przeciwutleniaczy. Rodnik DPPH ma ciemnofioletowy kolor z powodu upośledzonego elektronu, a wychwytywanie rodników można śledzić spektrofotometrycznie przez utratę absorbancji przy 517 nm, gdy powstaje bladożółta postać nierodnikowa.

Porcje soku marula (1,0 μl) zmieszano z 1 ml 0,1 mmol DPPH/l w etanolu i w sposób ciągły monitorowano zmianę gęstości optycznej przy 517 nm. Zdolność ekstraktów soku marula do wychwytywania wolnych rodników porównano ze zdolnością wychwytywania wolnych rodników przez filtrowany sok marula (FIG. 3A i 3B).

Przy stężeniu 1,0 μl/ml filtrowany sok z maruli wywoływał 30% spadek gęstości optycznej przy 517 nm, natomiast produkt otrzymany z połączenia opisanych tu ekstraktów II i III (np. sok z maruli wzbogacony w wysoki poziom polifenoli) wywołało 21% spadek gęstości optycznej przy 517 nm. Najbardziej niezwykłą zdolność wychwytywania rodników wykazywał ekstrakt I, który indukował 54% spadek gęstości optycznej przy 517 nm (Figa. 3A). Przy wyższych stężeniach (2,0 μl/ml) przefiltrowany i odwirowany sok z maruli spowodował 60% spadek gęstości optycznej przy 517 nm. Podobnie, produkt otrzymany z połączenia opisanych tutaj ekstraktów II i III wywoływał 43% spadek gęstości optycznej przy 517 nm, a najbardziej niezwykłą zdolność wychwytywania rodników ponownie wykazywał ekstrakt I, który indukował 89% spadek gęstości optycznej gęstość przy 517 nm (FIGA. 3B).

LDL izolowano z osocza pochodzącego od zdrowych ochotników z normolipidemią, przez ultrawirowanie w gradiencie nieciągłej gęstości [Aviram, M. (1983) Separacja lipoprotein w osoczu przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości nieciągłej u pacjentów z hiperlipoproteinemią. Biochem. Med. 30, 111-118]. LDL przemyto przy d=1,063 g/ml, dializowano wobec 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L Na₂EDTA (pH 7,4) w 4°C. Następnie LDL sterylizowano przez filtrację (0,45 µM), trzymano w atmosferze azotu w ciemności w 4°C i użyto w ciągu 2 tygodni. Stężenie białka LDL oznaczono odczynnikiem Folin Phenol. Przed utlenianiem LDL dializowano wobec wolnego od EDTA roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4, w temperaturze 4°C.

LDL (100 μg białka/ml) inkubowano przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej ze wzrastającymi stężeniami ekstraktów soku marula. Następnie 5 μmol/l CuSO₄ dodano i probówki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Pod koniec inkubacji określono stopień utlenienia LDL, mierząc wytworzoną ilość substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) i nadtlenków lipidów [Aviram M, Vaya J. Markery utleniania lipoprotein o małej gęstości. Metody Enzymol. 2001; 335:244-56; i Buege JA, Aust SD Microsomal lipid peroxidation. Metody Enzymol. 52: 302-310 (1978)]. Test nadtlenku lipidów (PD) analizuje tworzenie nadtlenków lipidów przez ich zdolność do przekształcania jodku w jod po inkubacji przez 18 godzin w 25°C, jak zmierzono spektrofotometrycznie przy 365 nm [G. Jurgensa. Spektrofotometryczny test nadtlenków lipidów w lipoproteinach surowicy przy użyciu odczynnika dostępnego w handlu. J. Lipid Res. 30: 627-630, 1986].

Utlenianie LDL mierzono jako TBARS (FIGA. 4A) lub jako tworzenie nadtlenków lipidów (FIGA. 4B). Dodanie rosnących stężeń ekstraktów z soku marula hamowało utlenianie LDL indukowane jonami miedzi w sposób zależny od dawki. IC₅₀ (hamowanie utleniania LDL o 50%) dla przefiltrowanego i odwirowanego soku marula wyniosła 0,80 μl/ml dla TBARS (FIGA. 5A) i 0,65 μl/ml dla nadtlenków lipidów (FIGA. 5B) formacja. Nieco niższe wyniki uzyskano dla ekstraktu I (0,50 μl/ml zarówno dla TBARS, jak i tworzenia nadtlenków lipidów). Przeciwnie, IC₅₀ wartość dla produktu otrzymanego z połączenia opisanych ekstraktów II i III była najwyższa (odpowiednio 1,35 i 1,50 dla TBARS i nadtlenków lipidów).

Makrofagi J-774A.1 wstępnie inkubowano z 10 i 30 μg równoważników GAE/ml produktów z soku marula, a następnie komórki analizowano pod kątem aterogenności, którą oceniano jako stan oksydacyjny makrofagów, wychwyt lipoprotein przez makrofagi, wypływ cholesterolu za pośrednictwem HDL i biosyntezy cholesterolu

Stan oksydacyjny makrofagów określono za pomocą testu cytometrii przepływowej z dioctanem dichlorofluorescyny (DCFH-DA). DCFH-DA jest niepolarnym barwnikiem, który dyfunduje do komórek. W komórkach ulega hydrolizie do niefluorescencyjnej pochodnej 2′,7′-dichlorofluorescyny (DCFH), która jest polarna i uwięziona w komórkach. W warunkach stresu oksydacyjnego DCFH jest utleniany do DCF, który jest związkiem fluorescencyjnym. J774 A.1 (2×10⁶) makrofagi inkubowano z 2,5 x 105⁻⁵ mol/l DCFH-DA przez 30 minut w 37°C. Reakcję zatrzymywano przez przemywanie PBS w 4°C. Fluorescencję komórkową określono za pomocą aparatu do cytometrii przepływowej (FACS-SCAN, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ). Pomiary wykonano przy 510 do 540 nm po wzbudzeniu komórek przy 488 nm laserem jonowym argonu.

Inkubacja makrofagów J-774 A.1 przez 18 godzin w temperaturze 37°C z ekstraktem I i przefiltrowanym sokiem marula zmniejszyła komórkowy stres oksydacyjny, mierzony testem DCFH, odpowiednio o 6% i 7%. Produkt otrzymany z połączenia opisanych tu ekstraktów II i III nie miał wpływu na stan stresu oksydacyjnego makrofagów (FIGA. 6).

LDL (1 mg/ml) inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C z 5 μmol/L świeżo przygotowanego CuSO₄. Utlenianie zakończono przez schłodzenie w temperaturze 4°C. Stopień utlenienia LDL określono za pomocą testu TBARS.

LDL i Ox-LDL skoniugowano z fluoroizotiocyjanianem (FITC) do badań wychwytu komórkowego. Lipoproteiny (2,5 mg białka/ml) dializowano przez noc w 4°C wobec kilku zmian buforu boranowego zawierającego 0,1 M boran, 25 mM tetraboran sodu, 75 mM NaCl, pH 8,6. Przed koniugacją (1 h) pH buforu do dializy zmieniono na 9,4. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC; Sigma-Aldrich) rozpuszczono w dimetyloformamidzie (Merck) i wkroplono do roztworu lipoprotein do uzyskania końcowego stężenia 0,2 mg/ml, a następnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Lipoproteiny sprzężone z FITC oddzielono od nieskoniugowanego FITC metodą chromatografii wykluczania na kolumnie PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech), eluując 10 mM buforem fosforanowym, pH 8,0. Lipoproteiny znakowane FITC (2 mg/ml) stosowano natychmiast w badaniach wychwytu.

Makrofagi J774 A.1 inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny z LDL skoniugowanym z FITC lub Ox-LDL w końcowym stężeniu 25 μg białka/ml. Wychwyt lipoproteiny określono za pomocą cytometrii przepływowej. Pomiary fluorescencji komórkowej określone za pomocą FACS wykonano przy 510 nm do 540 nm po wzbudzeniu komórek przy 488 nm laserem jonowym argonu. Fluorescencję komórkową mierzono pod względem średniej intensywności fluorescencji (MFI).

Inkubacja makrofagów J-774 A.1 przez 18 godzin w temperaturze 37°C z sokiem marula (10 μg/ml GAE) nie miała wpływu na wychwyt LDL przez makrofagi. Przy wyższym stężeniu 30 μg/ml GAE tylko produkt zawierający opisane tu ekstrakty II i III zmniejszał wychwyt LDL przez makrofagi o 9% (FIGA. 7). Inkubacja makrofagów J-774 A.1 przez 18 godzin w temperaturze 37°C z ekstraktem I, produktem otrzymanym przez połączenie opisanych tutaj ekstraktów II i III oraz przefiltrowanego soku z maruli, albo o stężeniu 10 μg/ml GAE albo 30 μg/ml GAE zmniejszyło pobieranie Ox-LDL przez makrofagi odpowiednio o 12% i 7% (ekstrakt I), o 27% (sok marula o wysokiej zawartości polifenoli) oraz o 8% i 6% (filtrowany sok marula) (FIGA. 8).

Makrofagi J774 A.1 inkubowano z [³cholesterol znakowany H] (2 μCi/ml) przez 1 godzinę w 37°C, a następnie komórki przemyto lodowatym PBS (x3) i dalej inkubowano pod nieobecność lub w obecności 100 μg białka HDL/ml przez 3 godziny w 37° C. Komórkowe i średnie [³H] oznaczono ilościowo i wypływ cholesterolu za pośrednictwem HDL obliczono jako stosunek [³H]-etykieta na nośniku/([³H]-etykieta na nośniku+[³H]-etykieta w komórkach). Inkubacja makrofagów J-774 A.1 przez 18 godzin w temperaturze 37°C z filtrowanym sokiem marula (10 μg/ml GAE) zwiększyła wypływ cholesterolu z makrofagów do HDL o ~10%. Jednak wszystkie inne produkty z soku marula nie wpływały na wypływ cholesterolu za pośrednictwem HDL w żadnym zastosowanym stężeniu (FIGA. 9).

Makrofagi J774 A.1 inkubowano z [³H] octan, a następnie ekstrakcja lipidów komórkowych heksanem:izopropanolem (3:2, obj./obj.) i rozdzielenie metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach z żelem krzemionkowym. Plamy niezestryfikowanego cholesterolu wizualizowano za pomocą oparów jodu, zeskrobano do fiolek scyntylacyjnych i policzono pod kątem radioaktywności. Inkubacja makrofagów J-774 A.1 przez 18 godzin w temperaturze 37°C z ekstraktem I, produktem otrzymanym z połączenia opisanych tu ekstraktów II i III oraz soku marula po filtracji, wszystkie w stężeniu 30 μg/ml GAE, zredukowane biosynteza cholesterolu w makrofagach odpowiednio o 18%, 7% i 8% (FIGA. 10).

Nowonarodzone szczury Wistar otrzymano z Harlan Laboratories. Hodowle pierwotnych astrocytów szczurów przygotowano z kory mózgowej 1-2 dniowych nowonarodzonych szczurów Wistar. Procedura ta została zatwierdzona przez Institutional Animal Care and Use Committee. Astrocyty wysiano na 24-studzienkowe płytki w ilości odpowiednio 100 000 lub 80 000 komórek/0,5 ml/studzienkę. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w obecności 2% surowicy (FCS). Oryginalną pożywkę komórek odessano i do komórek dodano świeżą pożywkę. Rozcieńczenia H₂O₂ i soki marula w pożywce wzrostowej były świeżo przygotowane z roztworów podstawowych tuż przed każdym doświadczeniem i były używane natychmiast. Każde traktowanie przeprowadzono w tetraplikacjach. Końcowe stężenie H₂O₂ wynosiła 200 μM.

Testy hodowli komórek neuronalnych

Określenie żywotności komórek — Żywotność komórek określono przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do testów kolorymetrycznych (dostarczonego przez firmę Roche), w oparciu o pomiar aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) uwalnianej z cytosolu uszkodzonych komórek do supernatantu.

Ochronne działanie ekstraktów — W celu określenia optymalnych warunków (pod względem czasu i dawki) soków do wywierania przypuszczalnego działania ochronnego, komórki poddawano wstępnej obróbce różnymi ilościami każdego soku przez różne okresy czasu, a produkty miały działanie ochronne przed stresem oksydacyjnym wygenerowane przez H₂O₂ zostały ocenione. Soki (w rozcieńczeniu 1:125, 1:500, 1:800 i 1:4000) dodawano jednocześnie z H₂O₂ lub wstępnie inkubowano przez dwie godziny z komórkami przed ich dodaniem. Toksyczność monitorowano 20 godzin później. FIGA. 11 pokazuje, że we wszystkich badanych stężeniach i dla wszystkich soków jednoczesne dodanie soków z H₂O₂ nie jest ochronny. Jednak preinkubacja przez 2 godziny z komórkami przed H₂O₂ dodatek spowodował działanie ochronne wszystkich soków, przy czym ekstrakt I wykazuje najskuteczniejsze działanie ochronne przy stosowaniu w niskich stężeniach (1:4000).

Eksperymenty z ekstraktami maruli w niskich stężeniach (rozcieńczenia 1:1000-1:8000)—Poniższe doświadczenia przeprowadzono przy niższych stężeniach produktów (rozcieńczenia 1:1000-1:8000), wynoszących ~55-450 μg/100 ml witaminy odpowiedniki C.

Zbadano wpływ okresu preinkubacji (2 h vs. 6 h) komórek z sokiem oraz stężenia produktu (1:1000-1:8000). FIGA. 12 pokazuje, że podczas gdy 2-godzinna preinkubacja z ekstraktem I powodowała tylko ~20% ochrony we wszystkich testowanych stężeniach, 6-godzinna preinkubacja dawała ponad 80% ochronę.

W innym eksperymencie zbadano wpływ czasu inkubacji i stężenia przy 2 rozcieńczeniach (1:1000 lub 1:4000) każdego soku, przefiltrowanego soku marula i ekstraktu I, przez 2 lub 6 godzin przed dodaniem H₂O₂ (FIGA. 13). Ekstrakt I okazał się najbardziej skuteczny (ochrona 70%). Filtrowany sok z maruli również wykazywał znaczące działanie ochronne (ochrona 40%).

4. Protokół kliniczny

Do badania zrekrutowano dziesięciu zdrowych ochotników (tab. 1), niepalących, bez zaburzeń metabolicznych, ze stężeniem cholesterolu w osoczu poniżej 200 mg/dl i nieleczonych lekami. Wszyscy badani podpisali formularz zgody przed przystąpieniem do badania. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Helsiński Rambama (nr 2452).

Wszyscy uczestnicy spożywali 200 ml pasteryzowanego soku dziennie wraz z głównym posiłkiem przez okres 3 tygodni. Wszyscy badani włączeni do badania kontynuowali dotychczasowy tryb życia. Ciśnienie krwi mierzono w czasie zero (przed rozpoczęciem badania), po 3 tygodniach i na końcu badania (po 4 tygodniach wypłukiwania). Próbki krwi (25 ml) pobrano do analiz w czasie zero (linia bazowa – przed rozpoczęciem badania), po 3 tygodniach spożywania soku marula i 4 tygodniach po zakończeniu spożywania soku (wymywanie).

Wszystkie próbki surowicy krwi zamrożono w temperaturze -80°C do czasu analizy. Analizy biochemiczne w surowicy przeprowadzono przy użyciu dostępnych na rynku zestawów diagnostycznych i obejmowały pomiary stężenia glukozy, wapnia, czynności nerek (BUN, kreatyniny oraz elektrolitów sodu i potasu), czynności wątroby (CK, AST i bilirubina całkowita), cholesterolu całkowitego, HDL —cholesterolu, cholesterolu LDL i triglicerydów ogółem. Poziomy kwasu moczowego (jako możliwego przeciwutleniacza) w surowicy mierzono za pomocą dostępnego w handlu zestawu.

Analiza stresu oksydacyjnego próbek surowicy

Siła przeciwutleniająca redukująca żelazo (FRAP): Roboczy odczynnik FRAP przygotowano przez zmieszanie 25 ml buforu octanowego, 2,5 ml roztworu 2,4,6-tripirydylo-s-triazyny (TPTZ) i 2,5 ml FeCL₃*6H₂O rozwiązanie. Wodne roztwory 1 mM FeSO4₄*7H₂O w stężeniach 5, 10, 20, 30, 40, 50 i 100 mM zastosowano do standardowej krzywej kalibracji. Odczynnik FRAP (świeżo przygotowany) ogrzano do 37°C i ślepą próbę odczynnika odczytano spektrofotometrycznie przy 593 nm. Próbkę surowicy (30 μl) zmieszano z 90 μl wody. Następnie dodano 900 μl odczynnika FRAP i szybko wymieszano. Absorbancję odczytywano po 0,5 sekundy i co 15 sekund przez 4 minuty. Zmiana absorbancji (A_{593 nm}) między końcową a początkową gęstością optyczną obliczono dla każdej próbki, a następnie odniesiono do Fe⁺² stężenie na krzywej wzorcowej (badane równolegle).

Peroksydacja lipidów w surowicy

Surowicę rozcieńczono 1:4 (v:v) solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie inkubowano pod nieobecność lub w obecności 100 mmol/l generatora wolnych rodników, chlorowodorku 2,2′-azobis-2-amidynopropanu (AAPH) przez 2 godziny w 37°C. Peroksydację lipidów w surowicy oznaczano przez pomiar wytworzonej ilości substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) i nadtlenków lipidów metodami spektrofotometrycznymi. Test nadtlenku lipidów (PD) analizuje tworzenie nadtlenków lipidów przez ich zdolność do przekształcania jodku w jod po inkubacji przez 18 godzin w 25°C, jak zmierzono spektrofotometrycznie przy 365 nm.

Jak wskazują wyniki badania, spożycie nie miało istotnego wpływu na ciśnienie krwi; poziomy glukozy i wapnia w surowicy nie uległy istotnej zmianie po spożyciu, a kontynuacja spożycia nie wpłynęła znacząco na testy czynnościowe nerek. Podobnie spożycie skutkowało zasadniczo niezmienionym poziomem elektrolitów we krwi i czynnością wątroby. Jednak poziomy triglicerydów w surowicy zmniejszyły się o 7% po spożyciu, a efekt utrzymywał się po 4-tygodniowym okresie wypłukiwania (Tabela 2).

Spożywanie przez okres 3 tygodni istotnie (p<0,02) obniżyło stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy o 8% (tab. 3).

To zmniejszenie może być związane ze znacznym (p<0,01) zmniejszeniem poziomu cholesterolu LDL o 17%. Jednak te redukcje nie utrzymywały się po okresie wypłukiwania, ponieważ poziomy cholesterolu całkowitego, jak również cholesterolu LDL, powróciły do ​​poziomu wyjściowego po 4 tygodniach okresu wypłukiwania, podczas którego badany nie spożywał soku. Po spożyciu soku stężenie cholesterolu HDL w surowicy istotnie (p<0,03) wzrosło (p<0,03) o 10%, a spadek ten utrzymywał się, choć w mniejszym stopniu (tylko o 7%), po okresie wypłukiwania.

Tabela 4 przedstawia wpływ na stres oksydacyjny w surowicy. Próbki surowicy poddano utlenianiu indukowanemu przez AAPH. Tworzenie nadtlenku lipidów było istotnie (p<0,03) zmniejszone w próbkach surowicy pobranych po spożyciu przez 3 tygodnie. Jednak efekt ten nie utrzymywał się po okresie wypłukiwania. W próbkach surowicy pobranych po spożyciu „moc przeciwutleniająca”, mierzona testem FRAP, wzrastała w okresie spożywania, a nawet dalej wzrastała, osiągając znaczny wzrost o 8% po okresie wypłukiwania. Zmniejszenie stresu oksydacyjnego w surowicy może być wynikiem zmniejszenia stężenia lipidów w surowicy (mniej dostępnego substratu do utleniania, a także działanie silnych antyoksydantów soku z maruli).

Wpływ spożycia pasteryzowanego soku na stres oksydacyjny w surowicy podsumowano w FIG. 14A-B. Próbki surowicy poddano utlenianiu indukowanemu przez AAPH. Tworzenie nadtlenku lipidów (FIGA. 14A) uległa istotnemu (p<0,03) zmniejszeniu w próbkach surowicy pobranych po spożyciu soku przez okres 3 tygodni. Efekt ten nie utrzymywał się po okresie wymywania. Zdolność antyoksydacyjna mierzona testem FRAP (FIGA. 14B), wzrosła w próbkach surowicy pobranych po spożyciu pasteryzowanego soku marula i, co zaskakujące, jeszcze bardziej wzrosła, osiągając znaczny wzrost o 8%, po okresie wypłukiwania.