Extractos de Sclerocarya birrea (US8445040B2)

La presente invención se refiere en general a extractos hidrosolubles obtenidos a partir de la Sclerocarya birrea frutos y usos de los mismos.

La marula (Sclerocarya birrea, Familia: Anacardiaceae) es un árbol caducifolio de tamaño mediano a grande, con tronco erecto y copa redondeada. La planta se usa como fuente de alimento hoy en día como se usaba en la antigüedad. El fruto de la marula es comestible, por lo general se come crudo o se procesa en una variedad de productos alimenticios como una gelatina y también se elabora en una cerveza alcohólica, conocida por la gente de Vhavenda como Mukumbi.

Los usos y aplicaciones medicinales de la marula incluyen el uso de la corteza y las hojas para tratar enfermedades relacionadas con bacterias y diabetes [1,2] y también diarrea, como se describe en la publicación de patente australiana no. 2000/29790 [3].

Publicación internacional núm. El documento WO 03/092634 [4] describe el uso de aceite de marula en preparaciones tópicas para inhibir la formación de tejido cicatricial en la piel.

Se demostró que la fruta de Marula posee una mayor capacidad antioxidante total [5], tiene la capacidad de inhibir la peroxidación de fosfolípidos y tiene una actividad de eliminación de radicales de anión superóxido [6]. Publicación internacional núm. WO 06/097806 [7] revela que varias partes de la planta de marula tales como corteza, hojas, frutos, raíces y semillas contienen antioxidantes hidrófobos, que pueden obtenerse de la planta mediante maceración y/o extracción.

Publicaciones

Aunque se ha informado que la fruta de marula es rica en antioxidantes, hasta el momento no se ha informado sobre la preparación y el uso de extractos de la fruta de marula en el tratamiento de enfermedades y trastornos como la aterosclerosis y las enfermedades neurodegenerativas.

Los resultados sorprendentes, divulgados aquí, indican que los extractos preparados a partir del jugo de marula no solo son estables durante largos períodos de tiempo sino que, lo que es más importante, poseen beneficios terapéuticos diferentes y, en algunos casos, mejores que los exhibidos por el jugo de marula no tratado. Se ha demostrado que los extractos de la invención afectan favorablemente los lípidos sanguíneos, como se muestra por una reducción de las LDL séricas, por un incremento de las HDL séricas y por una atenuación del estrés oxidativo sérico; los extractos han demostrado eficacia en el tratamiento del daño por estrés oxidativo, aterosclerosis, neurodegeneración y trastornos asociados con los mismos.

Los extractos de jugo de marula de la presente invención también son efectivos para prevenir la neurodegeneración, como lo demuestra su influencia protectora sobre las células neuronales expuestas al daño de los radicales libres.

La presente invención también describe el uso de extractos de jugo de marula como antioxidantes para su uso en una gran variedad de aplicaciones, por ejemplo, uso en complementos alimenticios para generar, por ejemplo, un efecto antiaterogénico en sujetos sanos y no sanos (humanos y no sanos). animales humanos) y como agentes para tratar o prevenir enfermedades neurodegenerativas asociadas.

Así, en un aspecto de la presente invención, se proporciona un extracto derivado del fruto de marula, excluyendo la semilla, siendo dicho extracto obtenido por un proceso que comprende someter el jugo recolectado del fruto de marula a una extracción con uno o más de un acuoso solución, un solvente orgánico y una mezcla de los mismos, es decir, para así obtener del jugo de marula un extracto que tenga los beneficios biológicos deseados.

El jugo de marula obtenido de la fruta de marula se puede filtrar antes de la extracción para eliminar los restos de fruta, como restos de semillas y otras materias insolubles. La filtración se puede llevar a cabo utilizando cualquier método conocido en la técnica para filtrar bebidas, como, entre otros, filtración con tierra de diatomeas (DE) y filtración por membrana.

En algunas realizaciones, el jugo de marula obtenido de la fruta de marula se pasteuriza antes de la extracción para retardar el crecimiento microbiano en el jugo al reducir el número de patógenos viables en el mismo. Normalmente, la pasteurización se realizaba exponiendo el jugo a temperaturas por debajo del punto de ebullición. En algunas realizaciones, la pasteurización se logra mediante uno o más métodos de pasteurización conocidos en la técnica, por ejemplo, controlados por agencias nacionales de seguridad alimentaria (como el USDA en los Estados Unidos y la Agencia de Normas Alimentarias en el Reino Unido). Algunos ejemplos no limitativos incluyen pasteurización a alta temperatura/corto tiempo (HTST), pasteurización de vida útil extendida (ESL), pasteurización a temperatura ultra alta (UHT o ultratratamiento) y pasteurización por lotes o en cuba.

El término 'extracto' como se usa aquí se refiere a un producto soluble en agua obtenido de cualquier parte de la fruta de marula o cualquier parte derivada de la misma, excluyendo la semilla, pero incluyendo uno o más de mesocarpio, endocarpio, corteza (piel exterior gruesa), y/o piel (exocarpio), empleando un método seleccionado entre expresión, absorción, maceración, liofilización, destilación y cualquier combinación de dos o más de estos procesos.

Las sustancias extraídas, por separado o en combinación, se pueden formar en cualquier formulación deseada, incluida una solución acuosa, un sólido como un polvo seco, un gránulo o una bolita, un concentrado, por ejemplo, un semilíquido con una consistencia de jarabe que puede obtenerse por evaporación de todo o casi todo el contenido líquido del extracto, o de cualquier otra forma. En general, los métodos de extracción de material pueden variar mutatis mutandis dependiendo de la edad del fruto de marula, el subtipo, la época de cosecha, la región de crecimiento, las sustancias a extraer, su estabilidad y otros factores que son conocidos por un experto en la materia.

En algunas realizaciones, el extracto de la invención se obtiene poniendo en contacto el jugo de marula con una solución acuosa para extraer uno o más ingredientes o una combinación de los mismos. La 'solución acuosa' puede ser, en términos más generales, agua (en algunas realizaciones, agua de concentraciones minerales naturales variables) o agua destilada o purificada (destilada o purificada con cualquier otro método), una solución salina acuosa que comprende una o más sales o un mezcla de agua con uno o más disolventes polares miscibles en agua, por ejemplo, C₁-C₄ alcoholes y cetonas.

En algunas realizaciones, el disolvente acuoso es una mezcla de agua y al menos un alcohol. En algunas realizaciones adicionales, el disolvente acuoso es una mezcla de agua y etanol, en la que la relación agua:etanol es una de 1:1, 1:2. . . 1:5 . . 1:10 . . 1:100 . . . 1:1,000 . . . etc., respectivamente, o 2:1, 3:1. . . 5:1 . . . 10:1. . . 100:1. . . 1.000:1, etc., respectivamente. También se incluye cualquier otra relación intermedia.

La extracción puede emplear alternativamente un disolvente orgánico solo o en combinación con otro disolvente de este tipo. En algunas realizaciones, el proceso de extracción es un proceso de varios pasos mediante el cual la fruta (jugo) de marula se pone en contacto primero con un solvente y luego con un solvente diferente para maximizar el rendimiento o enriquecer el extracto con uno o más componentes deseados.

Normalmente, el disolvente orgánico es al menos un alcohol, como metanol, etanol y alcohol isopropílico, o una cetona, como acetona. Cuando se usa etanol, puede usarse como una solución etanólica acuosa, por ejemplo, de entre aproximadamente 40 y 60% de etanol. También pueden usarse soluciones similares con los otros disolventes orgánicos miscibles en agua. El extracto obtenido del seguimiento de un extracto alcohólico se denomina aquí extracto I.

Debe entenderse en el contexto de la presente invención que la extracción etanólica, o cualquier otra extracción descrita en este documento, puede llevarse a cabo a cualquier temperatura conveniente. Será evidente para los expertos en la técnica que se producirá una extracción más eficiente si se agita el jugo, por ejemplo, revolviéndolo o sacudiéndolo, y/o si la mezcla se calienta a una temperatura superior a la temperatura ambiente (superior a 25-27 °C). .). También se pueden usar temperaturas de extracción más bajas, tales como aquellas por debajo de la temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el proceso de extracción se realiza a temperatura ambiente o a una temperatura entre 25 y 30°C.

También debe entenderse en el contexto de la presente invención que la extracción puede llevarse a cabo durante cualquier período de tiempo conveniente.

Un experto en la materia reconocería además que el proceso para obtener el extracto de la invención puede implicar la maceración de la fruta de marula para obtener trozos más pequeños de la fruta entera de la que se pueden obtener extractos mediante uno o más de otros métodos de extracción, como destilación. Alternativamente, el extracto puede obtenerse por expresión, es decir, exprimiendo el jugo de la fruta.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, antes de poner en contacto el jugo con uno o más solventes como se describe, la fruta, es decir, la fruta entera, excluyendo la semilla, o cualquier parte de la misma, puede ser pretratada por maceración, expresión o cualquier otro proceso.

El jugo obtenido de la fruta de marula se puede almacenar antes de la extracción o pretratamiento, por ejemplo, secado, durante períodos prolongados de tiempo. El almacenamiento puede ser a cualquier temperatura y condición, bajo las cuales se mantiene la frescura del jugo y se previene o minimiza la degradación. Dichas temperaturas pueden estar por encima o por debajo de la temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el jugo se puede almacenar en un refrigerador durante varias semanas o en el congelador durante varios años. Cuando se emplea la congelación del jugo, el proceso puede comprender además el paso de descongelar el jugo antes de la extracción o el procesamiento.

El secado del jugo puede lograrse calentando el jugo líquido al vacío, o bajo presión atmosférica, a una temperatura preestablecida que puede ser la temperatura ambiente o superior a la temperatura ambiente, en un lote o en cantidades más pequeñas para controlar el contenido de humedad de el extracto En un ejemplo no limitativo descrito en este documento, el secado se logra vertiendo el jugo sobre una superficie como una bandeja, en algunos casos cubierta con una lámina (por ejemplo, una lámina de aluminio) para calentar uniformemente el jugo y obtener una capa sustancialmente uniforme. de extracto seco de marula.

El concentrado húmedo (jarabe) obtenido por secado es de color amarillento a marrón oscuro, según la concentración y el tipo de extracto. El material seco se pulveriza fácilmente y tiene un color dorado brillante a marrón oscuro según el tipo de extracto. La materia seca es soluble en agua.

El extracto de marula que se obtiene posteriormente contiene cantidades variables de material volátil, dependiendo las cantidades de la duración del período de secado y la temperatura empleada. Sin pretender imponer ninguna teoría, tras la eliminación de los componentes volátiles, el concentrado, es decir, en algunas realizaciones, el extracto en polvo, contiene en comparación con el zumo de fruta entera una mayor concentración de componentes activos cuya presencia y combinación proporciona la alta actividad que no se observa en el fruto entero y que aquí se demuestra.

Así, el extracto se obtiene por un proceso que comprende poner en contacto el jugo de marula con un solvente acuoso como se define para obtener una suspensión de la cual se puede separar un extracto líquido.

En algunas realizaciones, el proceso comprende:

En algunas realizaciones, el jugo recolectado se seca o se pretrata como se describe antes de la extracción.

En realizaciones adicionales, la separación del extracto líquido del paso (iii) puede ser mediante centrifugación de la suspensión obtenida en el paso (ii) para separar el extracto líquido como sobrenadante de una masa sólida.

En algunas realizaciones adicionales, el proceso comprende:

En realizaciones adicionales, el proceso comprende:

En algunas otras realizaciones, el proceso comprende:

Cabe señalar que la separación del extracto líquido puede repetirse más de una vez, con una segunda cantidad del mismo o diferente solvente, y los sobrenadantes obtenidos de cada paso pueden combinarse y tratarse más para aislar, concentrar o procesar más el extracto. Por lo tanto, se pueden combinar dos o más sobrenadantes y se puede eliminar el disolvente y/o parte del agua, por ejemplo, usando cualquier método de eliminación de disolvente.

Cuando el material de partida del fruto incluya una materia sólida o en los casos en que el fruto de la marula se haya transformado en polvo seco o semiseco o en forma de gránulos, el extracto podrá separarse al menos en una fase sólida y una fase acuosa, teniendo cada fase la actividad biológica como se describe en este documento.

El extracto de la invención, obtenido empleando uno o más procesos como los descritos en este documento, puede caracterizarse por uno o más de los siguientes:

Así, la invención también proporciona un extracto de marula caracterizado por una capacidad antioxidante FRAP de un mínimo de 1.000 y 1.500 mg de equivalentes de vitamina C por 100 ml. Esto se compara con el FRAP medido para el jugo de marula sin tratar de entre 260 y 600 mg de vitamina C por 100 ml. en otras palabras, la capacidad FRAP de un extracto según la invención es entre 2 y 3 veces la actividad observada en el jugo original sin tratar.

En algunas realizaciones, el extracto que tiene la capacidad FRAP anterior es el extracto I.

La presente invención también proporciona un extracto que tiene una fracción polifenólica empobrecida, denominándose dicho extracto en el presente documento como extracto II. La fracción polifenólica, aquí como extracto III, puede separarse del jugo de marula, por ejemplo, mediante cromatografía del jugo de marula para obtener extracto II (agotado) y extracto III (fracción fenólica separada). En algunas realizaciones, el agotamiento de la fracción polifenólica se logra mediante un proceso que comprende filtrar el jugo de marula, por ejemplo, pasando el jugo a través de una o más capas de gasa (de diferentes grados, por ejemplo, desde tejido abierto hasta tejido extrafino utilizado de acuerdo con la calidad y la cantidad del jugo), opcionalmente centrifugar el jugo filtrado para eliminar el desmoche de la fruta, aplicar el jugo claro a la cromatografía, por ejemplo, cromatografía en columna utilizando columnas rellenas con resinas adsorbentes y de intercambio iónico Sepabeads, o C₁₈-sílice ligada o resinas para interacción hidrofóbica y cromatografía de fase reversa, recolectando las fracciones y combinando fracciones que tienen los mismos sólidos solubles totales (TSS).

En algunas realizaciones, la fracción de polifenoles puede recogerse del medio empleado para la cromatografía, por ejemplo, de las perlas de la columna, mezclando el medio, por ejemplo, perlas, con una solución alcohólica (etanol, metanol, etc.). Las fracciones alcohólicas pueden luego combinarse y evaporarse hasta sequedad.

De acuerdo con algunas realizaciones, para obtener un extracto con una mayor proporción de polifenoles:vitamina C, la fracción polifenólica (es decir, el extracto III) puede separarse del jugo y luego agregarse a la fracción empobrecida en polifenoles (es decir, el extracto II). . En algunas otras realizaciones, el extracto II se combina con el extracto I.

En algunas realizaciones, el extracto II se caracteriza por una capacidad antioxidante FRAP de al menos entre 250 y 500 mg de equivalentes de vitamina C por 100 ml.

Como se usa en este documento, "polifenoles" se refiere a un grupo de sustancias, caracterizadas por la presencia de más de una unidad de fenol o bloque de construcción por molécula. Los polifenoles generalmente se dividen en taninos hidrolizables (ésteres de ácido gálico de glucosa y otros azúcares) y fenilpropanoides, como ligninas, flavonoides y taninos condensados. En algunas realizaciones, los polifenoles obtenidos del jugo macular comprenden taninos hidrolizables, catequinas y ácidos hidroxicinámicos y/o derivados de los mismos.

En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona el uso de al menos un extracto de la invención para la preparación de una composición.

En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica.

En realizaciones adicionales, el extracto es el ingrediente activo presente en la composición junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La elección de un vehículo estará determinada en parte por el extracto particular, así como por el método particular usado para administrar la composición que lo comprende. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la presente invención. Las siguientes formulaciones para administración oral, en aerosol, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperatoneal, rectal y vaginal son meramente ejemplares y de ningún modo limitativas.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, como una cantidad eficaz del extracto disuelto en diluyentes, como agua, solución salina o jugo de naranja; (b) cápsulas, bolsitas, tabletas, pastillas y trociscos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del extracto, como sólidos o gránulos; c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado; y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y polietilenalcoholes, con o sin la adición de un tensioactivo, agente de suspensión o agente emulsionante farmacéuticamente aceptable. Las formas de cápsula pueden ser del tipo de gelatina ordinaria de cubierta dura o blanda que contiene, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y rellenos inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidón de maíz. Las formas de tabletas pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc. , ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes amortiguadores, agentes desintegrantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes y vehículos farmacológicamente compatibles. Las formas de pastillas pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia, emulsiones, geles y similares que contienen , además del extracto, los vehículos conocidos en la técnica.

Los extractos o composiciones de la presente invención, por ejemplo, la composición farmacéutica, solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden convertir en formulaciones de aerosol para administrar por inhalación. Estas formulaciones de aerosol se pueden colocar en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También pueden formularse como productos farmacéuticos para preparaciones no presurizadas, como en un nebulizador o atomizador.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y soluciones estériles acuosas y no acuosas. suspensiones que incluyen agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. El compuesto se puede administrar en un diluyente fisiológicamente aceptable en un vehículo farmacéutico, como un líquido estéril o una mezcla de líquidos, que incluye agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, como etanol, isopropanol o alcohol hexadecilico, glicoles, como propilenglicol o polietilenglicol, cetales de glicerol, como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, como poli(etilenglicol) 400, un aceite, un ácido graso, un ácido graso éster de ácido o glicérido, o un glicérido de ácido graso acetilado con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, como un jabón o un detergente, un agente de suspensión, como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites, que se pueden usar en formulaciones parenterales, incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y minerales. Los ácidos grasos adecuados para uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados. Los jabones adecuados para usar en formulaciones parenterales incluyen sales grasas de metales alcalinos, amonio y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos tales como , por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos y sulfosuccinatos de alquilo, olefina, éter y monoglicérido, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-β-aminopriopionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina, y (3) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contienen típicamente de alrededor de 0,5 a alrededor de 25% en peso del extracto en solución. En dichas formulaciones se pueden utilizar conservantes y tampones adecuados. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de la inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tengan un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones oscila entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente el 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilensorbitán, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en envases sellados de dosis unitaria o multidosis, como ampollas y viales, y se pueden almacenar en condiciones de secado por congelación (liofilizado) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua. , para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo descrito anteriormente.

Los extractos y composiciones de la presente invención pueden convertirse en formulaciones inyectables. Los requisitos para vehículos farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la materia. Ver Farmacéutica y Práctica de Farmacia, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y Manual de ASHP sobre medicamentos inyectables, En otro, 4^el ed., páginas 622-630 (1986).

Además, los extractos de la presente invención se pueden convertir en supositorios mezclándolos con una variedad de bases, como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o fórmulas en aerosol que contienen, además del ingrediente activo, los vehículos que se sabe que son apropiados en la técnica.

Como se indicó anteriormente, los extractos y composiciones de la invención pueden fabricarse, presentarse y/o almacenarse en cualquier forma, es decir, en forma de líquido, concentrado, polvo seco, solución, emulsión, solución madre o un concentrado de acciones.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para el tratamiento o la prevención de al menos una enfermedad o trastorno asociado con daño por estrés oxidativo.

El estrés oxidativo es el resultado de un desequilibrio en la homeostasis prooxidante/antioxidante que conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno tóxicas. Los radicales libres se forman cuando el oxígeno interactúa con ciertas moléculas y comienza una reacción en cadena de daño entre componentes celulares importantes. Así, la inflamación y los procesos oxidativos están interconectados. Además, el estrés oxidativo puede inducir la citotoxicidad de las células sanguíneas, estimular la liberación de citoquinas inflamatorias e inducir la producción de factores de crecimiento. El estrés oxidativo juega un papel fundamental en la formación de placas y, junto con la inflamación vascular inherente, puede ser un fuerte predictor de aterosclerosis.

Por lo tanto, como se usa en este documento, "daño por estrés oxidativo" se refiere al daño a las células, tejidos y/u órganos de un animal, incluidos los humanos, causado por un desequilibrio entre la producción de oxígeno reactivo y la capacidad de un sistema biológico para desintoxicar los intermedios reactivos o reparar fácilmente el daño resultante. Muy a menudo, las alteraciones en este estado redox normal pueden causar efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales libres que dañan todos o ciertos componentes de la célula, incluidas las proteínas, los lípidos y el ADN.

En algunas realizaciones, el daño por estrés oxidativo está asociado con un trastorno o una enfermedad seleccionada de aterosclerosis, enfermedad de parkinson, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades o trastornos neurodegenerativos, enfermedad ocular, síndrome de fatiga crónica y otros.

La aterosclerosis, la principal causa de morbilidad y mortalidad entre las personas con un estilo de vida occidental, se desarrolla como resultado de varios factores de riesgo. La hipercolesterolemia es un factor de riesgo importante para la aterosclerosis y la reducción de la concentración de colesterol plasmático mediante el tratamiento farmacológico reduce la incidencia cardiovascular. La lesión aterosclerótica se caracteriza por un estrés oxidativo acelerado y la formación de una especie reactiva de oxígeno (ROS), que ataca los lípidos en las lipoproteínas, así como en los macrófagos arteriales. La modificación oxidativa de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) juega un papel clave en la patogénesis de la aterosclerosis. El LDL oxidado (Ox-LDL) es un importante contribuyente al desarrollo de lesiones ateroscleróticas, ya que estimula la acumulación de colesterol en los macrófagos y la formación de células espumosas. En contraste con la aterogenicidad de las LDL, los niveles séricos de lipoproteínas de alta densidad (HDL) están inversamente relacionados con el riesgo de aterosclerosis. HDL ejerce un efecto inhibitorio sobre la oxidación de LDL y este efecto puede estar relacionado con su enzima asociada paraoxonasa 1 (PON1).

La aterosclerosis es también el proceso o trastorno que implica la acumulación de placa en el interior de las arterias, incluidas las del corazón, el cerebro, los brazos, las piernas y la pelvis. Por lo tanto, el término también puede referirse a la acumulación progresiva de células musculares lisas, células inmunitarias (p. ej., linfocitos, macrófagos o monocitos), productos lipídicos (p. ej., lipoproteínas o colesterol), productos de desecho celular, calcio u otras sustancias dentro del organismo. revestimiento interno de una arteria, lo que resulta en el estrechamiento u obstrucción del vaso sanguíneo y el desarrollo de enfermedades asociadas a la aterosclerosis.

Dado que la aterosclerosis se manifiesta en las arterias de tamaño grande y mediano, el tratamiento o la prevención a menudo afecta el desarrollo de un estado de inflamación crónica dentro de las arterias.

Por lo tanto, el extracto de la invención también es adecuado para el tratamiento y la prevención de estados que incluyen la aterosclerosis de las arterias coronarias que causa enfermedad de las arterias coronarias, infarto de miocardio, trombosis coronaria y angina de pecho; aterosclerosis de las arterias que irrigan el sistema nervioso central que provoca accidentes cerebrovasculares e isquemia cerebral transitoria; aterosclerosis de la circulación periférica que causa claudicación intermitente y gangrena; aterosclerosis de una arteria de la circulación esplácnica que causa isquemia mesentérica; y estenosis de la arteria renal.

Por lo tanto, la composición de la invención es además adecuada para su uso en el tratamiento o prevención de al menos una enfermedad o trastorno asociado con una o más concentraciones séricas de triglicéridos lipídicos, concentraciones séricas de colesterol y concentraciones séricas de colesterol total y LDL y disminución HDL- concentraciones de colesterol.

Tal como se usa en el presente documento, tal enfermedad o trastorno asociado con concentraciones séricas de triglicéridos lipídicos aumentadas, concentraciones séricas de colesterol y concentraciones séricas de colesterol total y LDL y concentraciones reducidas de colesterol HDL implican niveles anormalmente altos de colesterol (hipercolesterolemia) y/o niveles altos de colesterol LDL. o triglicéridos y/o concentraciones más bajas de HDL funcional, como enfermedad coronaria u otras formas de enfermedad cardiovascular, así como enfermedades o trastornos que implican el desarrollo de ateroma en las arterias (es decir, aterosclerosis), como hipocolesterolemia, enfermedad vascular periférica, diabetes y hipertensión.

El estrés oxidativo también se ha relacionado con la muerte de células neuronales que está asociada con diversas afecciones neurodegenerativas. Las enfermedades neurodegenerativas son condiciones en las que se pierden células del cerebro y la médula espinal. Normalmente, la neurodegeneración comienza mucho antes de que el paciente experimente algún síntoma. Dado que las células cerebrales están continuamente expuestas a especies reactivas de oxígeno generadas por el metabolismo oxidativo, el estrés oxidativo también es uno de los factores predisponentes en los trastornos neurológicos del adulto y se ha implicado en la patogenia de algunos de estos trastornos, como la enfermedad de Parkinson.

El extracto o composición de la invención también se usa para el tratamiento o prevención de al menos una enfermedad o trastorno neurodegenerativo asociado.

Las 'enfermedades o trastornos neurodegenerativos', en el contexto de la presente invención, se refieren a una o más condiciones en las que las células del cerebro y la médula espinal se pierden como resultado del deterioro de las neuronas o su vaina de mielina, lo que con el tiempo conduce a una disfunción. y discapacidades resultantes de esto. Así, las enfermedades o trastornos neurodegenerativos son aquellos que se relacionan con condiciones que causan problemas con los movimientos, como la ataxia, y también con condiciones que afectan la memoria y están relacionadas con la demencia. Algunos ejemplos no limitantes de enfermedades o trastornos neurodegenerativos incluyen alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjögren-Batten), encefalopatía espongiforme bovina (BSE), enfermedad de canavan, parálisis cerebral, síndrome de cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia asociada al VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia con cuerpos de Lewy, neuroborreliosis, enfermedad de Machado- enfermedad de Joseph (ataxia espinocerebelosa tipo 3), atrofia multisistémica, esclerosis múltiple, narcolepsia, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Childer, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, ataxia espinocerebelosa, atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski y tabes dorsal.

En aún otro de sus aspectos, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de al menos una enfermedad o trastorno asociado con daño por estrés oxidativo en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de un extracto de acuerdo con la invención. o una composición farmacéutica que comprende los mismos.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para el tratamiento o la prevención de al menos una enfermedad o trastorno asociado con una o más concentraciones séricas de triglicéridos lipídicos, concentraciones séricas de colesterol y concentraciones séricas de colesterol total y LDL y disminución de las concentraciones séricas de triglicéridos lipídicos. - concentraciones de colesterol en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un extracto según la invención o una composición farmacéutica que lo comprende.

En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o la prevención de al menos una enfermedad o trastorno neurodegenerativo asociado en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un extracto según la invención o una composición farmacéutica que comprende del mismo.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un antioxidante que comprende el extracto de la invención.

En todavía otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un agente reductor del colesterol que comprende el extracto de la invención.

Dentro del alcance de la presente invención, el término 'tratar y/o prevenir' se refiere a la administración de una cantidad terapéutica de la composición de la presente invención que es eficaz para mejorar los síntomas no deseados asociados con una enfermedad, para prevenir la manifestación de dicha síntomas antes de que ocurran, para ralentizar la progresión de la enfermedad, ralentizar el deterioro de los síntomas, potenciar el inicio del período de remisión, ralentizar el daño irreversible causado en la etapa crónica progresiva de la enfermedad, retrasar el inicio de dicho etapa progresiva, para disminuir la gravedad o curar la enfermedad, para mejorar la tasa de supervivencia o una recuperación más rápida, o para prevenir que ocurra la forma de la enfermedad o una combinación de dos o más de los anteriores.

Un extracto o una composición de la invención puede administrarse por cualquier método conocido por un experto en la materia. Típicamente, la administración de un extracto o una composición farmacéutica que comprende el mismo es de una cantidad efectiva del extracto o extractos comprendidos en la composición. La "cantidad efectiva" para los fines del presente se determina por las consideraciones conocidas en la técnica. La cantidad debe ser eficaz para lograr el efecto terapéutico deseado como se describe anteriormente, dependiendo, entre otras cosas, del tipo y gravedad de la enfermedad a tratar y del régimen de tratamiento. La cantidad eficaz normalmente se determina en ensayos clínicos diseñados apropiadamente (p. ej., estudios de rango de dosis) y la persona versada en la técnica sabrá cómo realizar correctamente dichos ensayos para determinar la cantidad eficaz. Como se sabe en general, una cantidad efectiva depende de una variedad de factores que incluyen la afinidad del ligando por el receptor, su perfil de distribución dentro del cuerpo, una variedad de parámetros farmacológicos como la vida media en el cuerpo, efectos secundarios no deseados, si cualquiera, en factores como la edad y el sexo, etc.

El extracto de la invención también se puede usar para preparar una composición para usar en una variedad de aplicaciones no farmacéuticas. En algunas realizaciones, la composición es una composición antioxidante para uso como conservante para una gran variedad de aplicaciones en la industria alimentaria, industria cosmética, terapéutica, etc., y para la inhibición de la oxidación de LDL inducida por iones de cobre in vitro o en vivo.

El extracto divulgado en este documento puede usarse adicionalmente como un suplemento nutricional o como un componente activo de dicho suplemento. En algunas realizaciones, el suplemento es adecuado para el consumo tanto de seres humanos como de animales no humanos, para la gestión del bienestar y el tratamiento y prevención de afecciones y trastornos asociados con el daño oxidativo.

Dentro del contexto de la presente invención, el suplemento nutricional, dependiendo de su naturaleza y forma física, por ejemplo, de naturaleza lipófila o hidrófila, puede comprender además uno o más emulsionantes, estabilizantes, antioxidantes y otros aditivos. Se utilizan emulsionantes compatibles con los alimentos, tales como fosfolípidos, por ejemplo, lecitina, mono- o triestearato de polioxietilensorbitán, monolaurato, monopalmitato, mono- o trioleato, un mono- o diglicérido. Estos emulsificantes, estabilizantes, antioxidantes y aditivos podrán ser adicionados al extracto de la invención de acuerdo al uso final de dicho extracto.

El suplemento nutricional aquí descrito también puede contener bioactivos sintéticos o naturales tales como aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, minerales, polifenoles, etc., que pueden ser agregados ya sea por vía seca o vía húmeda a dicha composición antes de la pasteurización y/o secado.

En algunas realizaciones, el suplemento nutricional es una fórmula nutricional completa, un producto lácteo, una bebida refrigerada o no perecedera, un agua mineral o purificada, una bebida líquida, una sopa, un suplemento dietético, un sustituto de una comida, una barra nutricional, un golosinas, una leche o un producto lácteo fermentado, un yogur, un polvo a base de leche, un producto de nutrición enteral, una fórmula infantil, un producto de nutrición infantil, un producto de cereales o un producto a base de cereales fermentados, un helado, un chocolate, café, un producto culinario como mayonesa, puré de tomate o aderezos para ensaladas o un alimento para mascotas. De acuerdo con estas realizaciones, el extracto de la invención se puede dispersar en los alimentos o bebidas para tener un aporte diario en nutrientes bioactivos, que depende principalmente del tipo de alimento en el que se dispersa el extracto, el efecto deseado y el tejido objetivo. . La cantidad del complemento alimenticio que debe consumir el individuo para obtener un efecto beneficioso también dependerá de uno o más factores diversos tales como el tipo de complemento y/o alimento y la edad y el peso del consumidor.

El suplemento nutricional para administración oral puede presentarse en cápsulas, cápsulas de gelatina, cápsulas blandas, tabletas, tabletas azucaradas, píldoras, pastas o pastillas, gomas o soluciones o emulsiones bebibles, jarabe o gel, con una dosis de aproximadamente 0,1 a 100% del extracto de la invención, que luego se puede tomar directamente con agua o por cualquier otro medio conocido. Este suplemento también puede incluir un edulcorante, un estabilizador, un antioxidante, un aditivo, un saborizante o un colorante.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Como se usa aquí, el proceso, el extracto o las composiciones de la invención pueden incluir pasos, ingredientes o partes adicionales, solo si los pasos, ingredientes o partes adicionales no alteran las características básicas y novedosas del proceso, extracto y composiciones reivindicados. Como se usa en este documento, la forma singular "un", "un" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención, tal como se delinearon anteriormente y se reivindicaron en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

1. Secado de Jugo de Marula

Los frutos de marula se recolectaron del suelo dentro de los 10 días desde el momento en que la fruta cayó de los árboles y luego se exprimieron con una prensa hidráulica a menos de 35 bar (Prensa de aceitunas Enorossi modelo 250). El jugo se recolectó y se almacenó congelado a -20 °C durante diferentes períodos de hasta 3 años. Inmediatamente antes del secado, el jugo se descongeló y se pasó por encima de bandejas de papel de aluminio para formar una capa uniforme de 0,7 cm de espesor. Las bandejas que contenían el jugo se colocaron en un horno de vacío (Tuttnauer,horno seco esterilizador modelo 11-900), ajustado a 57°C y -760 mm mercurio, por un período de 3 días. Después de secar, teniendo aproximadamente un 1% de humedad, la sustancia sólida se molió para producir un polvo fácilmente soluble en agua. El polvo se mantuvo en un desecador, a temperatura ambiente, durante varios meses.

2. Preparaciones de extracto de marula

A. Extracto etanólico (referido en este documento como 'Extracto I')

Para preparar el extracto I, se trituraron hasta polvo 15 gramos de jugo de marula seco, se suspendieron en 50 ml de etanol al 50% y se colocaron en un agitador durante 20 min. La suspensión se centrifugó y el sobrenadante se transfirió a un matraz redondo. El paso se repitió con 25 ml adicionales de etanol al 50%. Los dos sobrenadantes se combinaron y el etanol y parte del agua se eliminaron utilizando un evaporador rotatorio. La solución acuosa final de 30 ml tenía una capacidad antioxidante FRAP (poder antioxidante reductor férrico) de 1390 mg de equivalentes de vitamina C por 100 ml (tres veces la capacidad antioxidante en comparación con los 460 mg de equivalentes de vitamina C por 100 ml medidos en el jugo original) . El extracto I puede reconstituirse en agua.

B. Fracción empobrecida en polifenoles (referida en este documento como "Extracto II"):

Para la preparación del extracto II, se pasó todo el jugo de marula a través de 8 capas de estopilla y se centrifugó para eliminar los restos de tejido de la fruta. Se aplicaron 200 ml de jugo claro a una columna de 20 ml de Sepabeads a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min. Se recogieron fracciones de 12 ml. Se combinaron las fracciones que contenían la misma concentración total de sólidos solubles (TSS) que el jugo claro (12,9%). La actividad antioxidante FRAP medida en esta fracción fue de 379 mg de equivalentes de vitamina C por 100 ml, aproximadamente el 83% de la medida en el jugo claro aplicado a la columna.

C. Fracción polifenólica (referida en este documento como "Extracto III").

Para la preparación del extracto III, se usó extracción discontinua para liberar los polifenoles de las perlas de la columna descritas anteriormente. Las perlas se transfirieron a un matraz de vidrio de fondo ancho y se mezclaron rigurosamente con una solución de etanol al 85%. Se recuperó la solución etanólica y se repitió el paso hasta que la solución de extracción quedó incolora. Las soluciones etanólicas recolectadas se combinaron, se colocaron en un matraz redondo y se evaporaron hasta sequedad con un evaporador rotatorio. La película seca se disolvió en 1 ml de agua. El producto resultante tenía una actividad FRAP de 5.735 mg de equivalentes de vitamina C por 100 ml, siendo ~12 veces la actividad medida en el jugo original.

Para la obtención de una bebida de marula enriquecida en polifenoles, se mezclaron 15 ml de fracción de jugo empobrecida en polifenoles (extracto II) con la fracción polifenólica aislada (extracto III); Se añadió agua a un volumen final de 25 ml de bebida de marula (que comprende los extractos II y III aquí descritos) con una actividad antioxidante FRAP de 446 mg equivalentes de vitamina C por 100 ml, de los cuales el 50% fueron aportados por vitamina C y el 50% por polifenoles, en comparación con ˜75% y 25%, respectivamente, en el jugo original.

Los polifenoles totales se determinaron espectrofotométricamente por el método de Singleton modificado para pequeños volúmenes [Singleton V L, et al, Am. J. Emology and Viticulture 16:144-158, 1965]. El ácido gálico (GA) sirvió como patrón. La solución madre de GA se preparó en agua a una concentración de 2 mM. Se usaron volúmenes de 10, 20, 40 y 60 microlitros para la curva estándar. Los resultados se expresaron luego como equivalentes de GA (GAE). Ocasionalmente, el pirogalol reemplazó al GA como estándar.

3. Métodos in vitro

HIGO. 1 muestra la concentración de polifenoles totales en cada uno de los jugos de marula filtrados, extracto etanólico de jugo de marula deshidratado (extracto I) y un producto obtenido al combinar los extractos II y III aquí descritos. La concentración total fue de 7,15, 8,34 y 9,35 mg de equivalentes de ácido gálico (GAE)/ml, respectivamente.

HIGO. 2 presenta los cromatogramas HPLC de jugo de marula y extractos de jugo. Cada extracto de jugo se lavó (1:3) con metanol al 80% suplementado con NaF 2 mM para extraer los antioxidantes. La suspensión se centrifugó y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 μm antes de la inyección. Se analizaron muestras de 20 μL utilizando el sistema HPLC LaChrom Merck Hitachi, que consta de bomba L7100, horno de columna L7350 (ajustado a 28 °C), mezclador-desgasificador L-7614 e inyector manual Rheodyne, acoplado con detector de longitud de onda múltiple (Jasco MD- 2010 Plus), interfaz (Jasco LC-Net II/ADC) y software científico (EZChrom Elite Client/Server versión 3.1.6 compilación 3.1.6.2433). Una columna Purospher®Star RP-18 con tapa en el extremo (cartucho LichroCART® de 250 × 4 mm, tamaño de partícula de 5 μm) con precolumna Lichrospher®100 RP-18 con tapa en el extremo (cartucho LichroCART® de 4 × 4 mm, tamaño de partícula de 5 μm ) fueron usados.

El extremo de la columna se conectó a un colector de fracciones (Pharmacia Fine Chemicals, FRAC-100). Las fases móviles consistieron en (A) ácido fosfórico (0,1%), pH 2,4 y (B) metanol; el gradiente de elución se ajustó para pasar de 0 a 100 % de metanol en 30 minutos. El caudal fue de 0,6 mL min⁻¹.

La concentración de vitamina C se evaluó a partir del área bajo los picos correspondientes del cromatograma usando vitamina C de grado HPLC (Fluka) para la calibración. El metanol era de grado HPLC (LiChrosolv Merck); el agua se purificó y filtró utilizando procedimientos conocidos; el ácido fosfórico (Frutarom) y el NaF (Sigma) fueron de grado analítico. La biblioteca estándar de fenólicos se construyó usando catequina, ácido clorogénico, cafeico y tánico de Sigma, y ​​ácido 2-hidroxibenzoico (salicílico), quercetina-3-β-glucósido y ácido elágico de Fluka.

Como indican los cromatogramas de HPLC, cada extracto I, II, III tenía una composición única con respecto a los compuestos fenólicos [ácidos fenólicos (PA) y taninos (T)] y vitamina C. Los tres extractos diferían significativamente en su composición antioxidante en comparación con el original. jugo.

La capacidad de eliminación de radicales libres de los productos de jugo de marula también se analizó mediante el ensayo DPPH [Malterud KM, Farbort TL, Huse ACE, Bredo Sund R. Antioxidant and radical scavenging effects of arthraquinones and anthorones. Farmacología. 1993: 47: 77-85]. DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo) es una sustancia generadora de radicales libres que se usa ampliamente para controlar las capacidades de eliminación de radicales libres (la capacidad de un compuesto para donar un electrón) de varios antioxidantes. El radical DPPH tiene un color violeta intenso debido a su electrón deteriorado, y la eliminación de radicales puede seguirse espectrofotométricamente por la pérdida de absorbancia a 517 nm, ya que se produce la forma no radical de color amarillo pálido.

Se mezclaron alícuotas del producto de jugo de marula (1,0 μl) con 1 ml de 0,1 mmol DPPH/L en etanol, y se controló continuamente el cambio en la densidad óptica a 517 nm. La capacidad de los extractos de jugo de marula para eliminar los radicales libres se comparó con la capacidad de eliminación de radicales libres del jugo de marula filtrado (FIGURAS. 3A y 3B).

A una concentración de 1,0 μl/ml, el jugo de marula filtrado indujo una disminución del 30 % en la densidad óptica a 517 nm, mientras que un producto obtenido mediante la combinación de los extractos II y III descritos en este documento (p. ej., jugo de marula enriquecido con altos niveles de polifenoles) indujo una disminución del 21% en la densidad óptica a 517 nm. La capacidad de captación de radicales más notable fue exhibida por el extracto I, que indujo una disminución del 54% en la densidad óptica a 517 nm (higo. 3A). A concentraciones más altas (2,0 μl/ml), el jugo de marula filtrado y centrifugado indujo una disminución del 60 % en la densidad óptica a 517 nm. De manera similar, el producto obtenido mediante la combinación de los extractos II y III descritos aquí indujo una disminución del 43 % en la densidad óptica a 517 nm, y la capacidad de captación de radicales más destacada fue exhibida nuevamente por el extracto I, que indujo una disminución del 89 % en la densidad óptica. densidad a 517 nm (HIGO. 3B).

La LDL se aisló del plasma derivado de voluntarios sanos normolipidémicos, mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad discontinuo [Aviram, M. (1983) Plasma lipoprotein separation by discontinuous densidad gradiente ultracentrifugación en pacientes hiperlipoproteinémicos. Bioquímica Medicina. 30, 111-118]. La LDL se lavó a d=1,063 g/ml, se dializó frente a 150 mmol/L de NaCl, 1 mmol/L de Na₂EDTA (pH 7,4) a 4°C. A continuación, la LDL se esterilizó por filtración (0,45 µM), se mantuvo bajo nitrógeno en la oscuridad a 4°C y se usó en 2 semanas. La concentración de proteína LDL se determinó con el reactivo Folin Phenol. Antes de la oxidación, la LDL se dializó frente a una solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de EDTA, pH 7,4 y a 4 °C.

LDL (100 μg de proteína/ml) se incubó durante diez minutos a temperatura ambiente con concentraciones crecientes de extractos de jugo de marula. Entonces, 5 μmol/L de CuSO₄ se añadió y los tubos se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Al final de la incubación, se determinó el grado de oxidación de LDL midiendo la cantidad generada de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y de peróxidos lipídicos [Aviram M, Vaya J. Marcadores de oxidación de lipoproteínas de baja densidad. Métodos Enzymol. 2001; 335:244-56; y Buege J. A., Aust S. D. Microsomal lipid peroxidation. Métodos Enzymol. 52: 302-310 (1978)]. El ensayo de peróxido de lípidos (PD) analiza la formación de peróxidos de lípidos por su capacidad de convertir yoduro en yodo después de 18 horas de incubación a 25ºC, medida espectrofotométricamente a 365 nm [G. Jurgens. Un ensayo espectrofotométrico para peróxidos de lípidos en lipoproteínas séricas usando un reactivo comercialmente disponible. J. Lipid Res. 30: 627-630, 1986].

La oxidación de LDL se midió como TBARS (HIGO. 4A) o como formación de peróxidos lipídicos (HIGO. 4B). La adición de concentraciones crecientes de extractos de jugo de marula inhibió la oxidación de LDL inducida por iones de cobre de una manera dependiente de la dosis. el CI₅₀ (inhibición de la oxidación de LDL en un 50 %) para el jugo de marula filtrado y centrifugado fue de 0,80 μl/mL para el TBARS (HIGO. 5A) y 0,65 μl/mL para los peróxidos lipídicos (HIGO. 5B) formación. Se obtuvieron resultados algo más bajos para el extracto I (0,50 μl/mL tanto para TBARS como para la formación de peróxidos lipídicos). Por el contrario, el CI₅₀ El valor para un producto obtenido mediante la combinación de los extractos II y III descritos aquí fue el más alto (1,35 y 1,50 para TBARS y para los peróxidos de lípidos, respectivamente).

Los macrófagos J-774A.1 se preincubaron con 10 y 30 μg de equivalentes de GAE/ml de productos de jugo de marula, y luego se analizó la aterogenicidad de las células, que se evaluó como el estado oxidativo de los macrófagos, la absorción de macrófagos de lipoproteínas, la salida de colesterol mediada por HDL y la biosíntesis del colesterol

El estado oxidativo de los macrófagos se determinó mediante el ensayo de citometría de flujo con diacetato de diclorofluorescina (DCFH-DA). DCFH-DA es un tinte no polar que se difunde en las células. En las células se hidroliza en el derivado no fluorescente 2′,7′-diclorofluorescina (DCFH), que es polar y queda atrapado dentro de las células. Bajo estrés oxidativo, el DCFH se oxida a DCF, que es un compuesto fluorescente. J774 A.1 (2×10⁶) los macrófagos se incubaron con 2,5 × 10⁻⁵ mol/L DCFH-DA durante 30 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo mediante lavados con PBS a 4 °C. La fluorescencia celular se determinó con un aparato de citometría de flujo (FACS-SCAN, Becton Dickinson, San Jose, Calif., EE. UU. ). Las mediciones se realizaron de 510 a 540 nm después de la excitación de las células a 488 nm con un láser de iones de argón.

La incubación de macrófagos J-774 A.1 durante 18 horas a 37°C con extracto I y jugo de marula filtrado redujo el estrés oxidativo celular, medido por el ensayo DCFH, en un 6% y un 7%, respectivamente. El producto obtenido mediante la combinación de los extractos II y III aquí descritos no tuvo ningún efecto sobre el estado de estrés oxidativo de los macrófagos (HIGO. 6).

LDL (1 mg/ml) se incubó durante 18 horas a 37 °C con 5 μmol/l de CuSO recién preparado₄. La oxidación se terminó por refrigeración a 4ºC. El grado de oxidación de LDL se determinó mediante el ensayo TBARS.

LDL y Ox-LDL se conjugaron con fluoroisotiocianato (FITC) para estudios de captación celular. Las lipoproteínas (2,5 mg de proteína/ml) se dializaron durante la noche a 4ºC frente a varios cambios de tampón de borato que contenía borato 0,1 M, tetraborato de sodio 25 mM, NaCl 75 mM, pH 8,6. Antes de la conjugación (1 h), el pH del tampón de diálisis se alteró a 9,4. Se disolvió isotiocianato de fluoresceína (FITC; Sigma-Aldrich) en dimetilformamida (Merck) y se añadió gota a gota a la solución de lipoproteínas para dar una concentración final de 0,2 mg/ml y luego se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las lipoproteínas conjugadas con FITC se separaron de las FITC no conjugadas mediante cromatografía de exclusión por tamaños en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech), eluyendo con tampón de fosfato 10 mM, pH 8,0. Las lipoproteínas marcadas con FITC (2 mg/ml) se usaron inmediatamente en los estudios de captación.

Los macrófagos J774 A.1 se incubaron a 37 ºC durante 3 horas con LDL conjugada con FITC u Ox-LDL a una concentración final de 25 μg de proteína/ml. La captación de la lipoproteína se determinó mediante citometría de flujo. Las medidas de fluorescencia celular determinadas por FACS se realizaron a 510 nm a 540 nm después de la excitación de las células a 488 nm con un láser de iones de argón. La fluorescencia celular se midió en términos de intensidad de fluorescencia media (MFI).

La incubación de macrófagos J-774 A.1 durante 18 horas a 37ºC con productos de jugo de marula (10 µg/ml GAE) no tuvo efecto sobre la absorción de LDL por los macrófagos. A una concentración mayor de 30 μg/ml de GAE, solo el producto que comprende los extractos II y III descritos en el presente documento redujo la captación de LDL de los macrófagos en un 9 % (HIGO. 7). Incubación de macrófagos J-774 A.1 durante 18 horas a 37°C con extracto I, producto obtenido de la combinación de los extractos II y III aquí descritos y jugo de marula filtrado, ya sea a 10 μg/ml GAE o 30 μg/ml GAE, redujo la captación de Ox-LDL por parte de los macrófagos en un 12 % y un 7 % (extracto I), en un 27 % (jugo de marula con alto contenido de polifenoles) y en un 8 % y un 6 % (jugo de marula filtrado), respectivamente (HIGO. 8).

Los macrófagos J774 A.1 se incubaron con [³colesterol marcado con H] (2 μCi/ml) durante 1 hora a 37 °C, seguido de lavado de células en PBS enfriado con hielo (x3) e incubación adicional en ausencia o presencia de 100 μg de proteína HDL/ml durante 3 horas a 37° C. Celular y medio [³Se cuantificaron las etiquetas H] y se calculó el flujo de salida de colesterol mediado por HDL como la proporción de [³H]-etiqueta en el medio/([³H]-etiqueta en el medio+[³H]-etiqueta en las células). La incubación de macrófagos J-774 A.1 durante 18 horas a 37 ºC con jugo de marula filtrado (10 μg/ml GAE) aumentó la salida de colesterol de los macrófagos a HDL en ~10 %. Sin embargo, todos los demás productos de jugo de marula no afectaron la salida de colesterol mediada por HDL en ninguna de las concentraciones utilizadas (HIGO. 9).

Los macrófagos J774 A.1 se incubaron con [³H], seguido de extracción de lípidos celulares con hexano:isopropanol (3:2, v/v) y separación por cromatografía en capa fina (TLC) en placas de gel de sílice. Las manchas de colesterol no esterificado se visualizaron mediante vapor de yodo, se rasparon en viales de centelleo y se contó la radiactividad. Incubación de macrófagos J-774 A.1 durante 18 horas a 37°C con extracto I, producto obtenido de la combinación de los extractos II y III aquí descritos y jugo de marula previa filtración, todo ello a una concentración de 30 μg/ml GAE, reducido biosíntesis de colesterol en macrófagos en un 18%, 7% y 8%, respectivamente (HIGO. 10).

Se obtuvieron ratas Wistar recién nacidas de Harlan Laboratories. Se prepararon cultivos de astrocitos primarios de rata a partir de cortezas cerebrales de ratas Wistar neonatales de 1-2 días de edad. Este procedimiento fue aprobado por el comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los astrocitos se sembraron en placas de 24 pocillos a 100.000 u 80.000 células/0,5 ml/pocillo, respectivamente. Todos los experimentos se realizaron en presencia de suero al 2% (FCS). Se aspiró el medio original de las células y se añadió medio fresco a las células. diluciones de H₂O₂ y los jugos de marula en el medio de crecimiento se prepararon recientemente a partir de soluciones madre justo antes de cada experimento y se usaron inmediatamente. Cada tratamiento se realizó en tetraplicados. La concentración final de H₂O₂ fue de 200 µM.

Ensayos de cultivo de células neuronales

Determinación de la viabilidad celular: la viabilidad celular se determinó utilizando un kit de ensayo colorimétrico comercial (suministrado por Roche), basado en la medición de la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada del citosol de las células dañadas en el sobrenadante.

Efectos protectores de los extractos: para determinar las condiciones óptimas (en términos de tiempo y dosis) para que los jugos ejerzan su efecto protector putativo, las células se trataron previamente con diferentes cantidades de cada producto de jugo durante diferentes períodos de tiempo y los efectos protectores de los productos contra el estrés oxidativo. generado por H₂O₂ fueron evaluados. Los jugos (a una dilución de 1:125, 1:500, 1:800 y 1:4000) se agregaron concomitantemente con H₂O₂ o preincubado durante dos horas con las células antes de su adición. La toxicidad se controló 20 horas más tarde. HIGO. 11 muestra que en todas las concentraciones probadas y para todos los productos de jugo, la adición concomitante de los jugos con H₂O₂ no es protector. Sin embargo, la preincubación durante 2 horas con las células antes de H₂O₂ La adición dio como resultado efectos protectores de todos los jugos, y el extracto I demostró la actividad protectora más efectiva cuando se usó en concentraciones bajas (1:4000).

Experimentos con extractos de marula a bajas concentraciones (diluciones 1:1000-1:8000)—Los siguientes experimentos se realizaron a concentraciones más bajas de los productos (diluciones 1:1000-1:8000), siendo ˜55-450 μg/100 ml de vitamina equivalentes de C.

Se probaron los efectos del período de preincubación (2 h frente a 6 h) de las células con los productos de jugo y de la concentración del producto (1:1000-1:8000). HIGO. 12 muestra que mientras 2 horas de preincubación con extracto I causaron solo ∼20 % de protección en todas las concentraciones probadas, 6 horas de preincubación dieron como resultado más del 80 % de protección.

En otro experimento se probó el efecto del tiempo de incubación y de la concentración con 2 diluciones (1:1000 o 1:4000) de cada jugo, jugo de marula filtrado y extracto I, por 2 o 6 hr antes de la adición de H₂O₂ (HIGO. 13). Se encontró que el extracto I era el más eficiente (70% de protección). El jugo de marula filtrado también exhibió una actividad protectora significativa (40% de protección).

4. Protocolo clínico

Se reclutaron para el estudio diez voluntarios sanos (tabla 1), no fumadores, sin alteraciones metabólicas, con colesterol plasmático inferior a 200 mg/dl y sin tratamiento farmacológico. Todos los sujetos firmaron un formulario de consentimiento antes de ingresar al estudio. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Rambam Helsinki (No. 2452).

Todos los participantes consumieron 200 mL de jugo pasteurizado por día, con su comida principal, por un período de 3 semanas. Todos los sujetos incluidos en el estudio continuaron con su estilo de vida habitual. La presión arterial se midió en el tiempo cero (antes del ingreso al estudio), después de 3 semanas y al final del estudio (después de 4 semanas de lavado). Se recolectaron muestras de sangre (25 ml) para análisis en el tiempo cero (Línea de base: antes del ingreso al estudio), después de 3 semanas de consumo de jugo de marula y 4 semanas después del final del consumo de jugo (lavado).

Todas las muestras de suero sanguíneo se congelaron a -80 ºC hasta su análisis. Los análisis bioquímicos en suero se realizaron empleando kits de diagnóstico disponibles en el mercado e incluyeron mediciones de glucosa, calcio, función renal (BUN, creatinina y los electrolitos sodio y kalio), función hepática (CK, AST y bilirrubina total), colesterol total, HDL —colesterol, colesterol LDL y triglicéridos totales. Los niveles de ácido úrico (como posible antioxidante) en el suero se midieron usando un kit disponible comercialmente.

Análisis de estrés oxidativo de muestras de suero

Poder antioxidante reductor férrico (FRAP): El reactivo FRAP de trabajo se preparó mezclando 25 ml de tampón de acetato, 2,5 ml de solución de 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) y 2,5 ml de FeCL₃*6H₂O solución. Soluciones acuosas de FeSO 1 mM₄*7H₂Se utilizaron concentraciones de O en 5, 10, 20, 30, 40, 50 y 100 mM para una curva de calibración estándar. El reactivo FRAP (recién preparado) se calentó a 37ºC y se leyó espectrofotométricamente un blanco de reactivo a 593 nm. La muestra de suero (30 μl) se mezcló con 90 μl de agua. Luego se agregaron 900 μl del reactivo FRAP y se mezcló rápidamente. La absorbancia se leyó después de 0,5 segundos y cada 15 segundos durante 4 minutos. El cambio en la absorbancia (A_593nm) entre la densidad óptica final e inicial se calculó para cada muestra y luego se relacionó con Fe⁺² concentración en la curva estándar (probado en paralelo).

Peroxidación de lípidos séricos

El suero se diluyó 1:4 (v:v) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se incubó en ausencia o presencia de 100 mmol/L del generador de radicales libres 2,2′-azobis-2-amidinopropano clorhidrato (AAPH) durante 2 horas a 37ºC. La peroxidación lipídica sérica se determinó midiendo la cantidad generada de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y de peróxidos lipídicos utilizando métodos espectrofotométricos. La prueba de peróxido de lípidos (PD) analiza la formación de peróxidos de lípidos por su capacidad para convertir el yoduro en yodo después de una incubación de 18 horas a 25 °C, medida espectrofotométricamente a 365 nm.

Como indican los resultados del estudio, el consumo no tuvo un efecto significativo sobre la presión arterial; los niveles séricos de glucosa y calcio no se alteraron significativamente después del consumo y las pruebas de función renal no se vieron significativamente afectadas por el consumo continuado. De manera similar, el consumo resultó en un nivel sanguíneo de electrolitos y una función hepática sustancialmente inalterados. Sin embargo, los niveles de triglicéridos séricos disminuyeron un 7 % después del consumo, y el efecto persistió después del período de lavado de 4 semanas (Tabla 2).

El consumo durante un período de 3 semanas redujo significativamente (p<0,02) las concentraciones de colesterol total en suero en un 8% (Tabla 3).

Esta reducción puede estar relacionada con una reducción significativa (p<0,01) de los niveles de colesterol LDL, en un 17%. Sin embargo, estas reducciones no persistieron después del período de lavado, ya que los niveles de colesterol total, así como los de colesterol LDL, volvieron a los niveles iniciales después de 4 semanas de período de lavado, durante las cuales el sujeto no consumió el jugo. El nivel sérico de colesterol HDL aumentó significativamente (p<0,03) en un 10 % después del consumo del jugo y esta reducción persistió, aunque en menor medida (solo en un 7 %), después del período de lavado.

La Tabla 4 muestra el efecto sobre el estrés oxidativo en suero. Las muestras de suero se sometieron a oxidación inducida por AAPH. La formación de peróxido de lípidos disminuyó significativamente (p<0,03) en las muestras de suero obtenidas después del consumo durante 3 semanas. Sin embargo, este efecto no se mantuvo después del período de lavado. En las muestras de suero obtenidas después del consumo, el "poder antioxidante", medido por el ensayo FRAP, aumentó durante el período de consumo y aumentó aún más, alcanzando una elevación significativa del 8 % después del período de lavado. La reducción del estrés oxidativo sérico puede ser el resultado de la reducción de las concentraciones de lípidos séricos (menos sustrato disponible para la oxidación, así como el efecto de los potentes antioxidantes del jugo de marula).

El efecto del consumo de jugo pasteurizado sobre el estrés oxidativo sérico se resume en FIGURAS. 14A-B. Las muestras de suero se sometieron a oxidación inducida por AAPH. Formación de peróxido de lípidos (HIGO. 14A) disminuyó significativamente (p<0,03) en las muestras de suero obtenidas después del consumo del jugo durante un período de 3 semanas. Este efecto no se mantuvo después del período de lavado. La capacidad de poder antioxidante, medida por el ensayo FRAP (HIGO. 14B), aumentó en las muestras de suero derivadas del consumo de jugo de marula pasteurizado y, sorprendentemente, aumentó aún más, alcanzando una elevación significativa del 8 %, después del período de lavado.