Extraits de Sclerocarya birrea (US8445040B2)

Il s'agit d'une demande de phase nationale déposée en vertu de 35 U.S.C. §371 en tant qu'étape nationale de PCT/IL2009/000192, déposée le 19 février 2009, revendiquant l'avantage en vertu de 35 U.S.C. §119(e) de la demande provisoire américaine n° 61/064 125, déposée le 19 février 2008, dont le contenu est incorporé ici par référence dans son intégralité.
DEPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne de manière générale des extraits hydrosolubles obtenus à partir de Sclerocarya birrea fruits et leurs utilisations.
CONTEXTE DE L'INVENTION
Le marula (Sclerocarya birrea, Famille : Anacardiaceae) est un arbre à feuilles caduques de taille moyenne à grande avec un tronc dressé et une cime arrondie. La plante est utilisée comme source de nourriture aujourd'hui comme elle l'était dans les temps anciens. Le fruit du marula est comestible, généralement consommé cru ou transformé en une variété de produits alimentaires tels qu'une gelée et également brassé dans une bière alcoolisée, connue par le peuple Vhavenda sous le nom de Mukumbi.
Les utilisations médicinales et les applications du marula comprennent l'utilisation de l'écorce et des feuilles pour traiter les maladies liées aux bactéries et le diabète [1,2] ainsi que la diarrhée comme décrit dans la publication de brevet australien no. 2000/29790 [3].
Publication internationale no. WO 03/092634 [4] divulgue l'utilisation d'huile de marula dans des préparations topiques pour inhiber la formation de tissu cicatriciel sur la peau.
Il a été démontré que le fruit de Marula possède une capacité antioxydante totale accrue [5], qu'il a la capacité d'inhiber la peroxydation des phospholipides et qu'il a une activité de piégeage des radicaux anion superoxyde [6]. Publication internationale no. WO 06/097806 [7] divulgue que diverses parties de la plante marula telles que l'écorce, les feuilles, les fruits, les racines et les graines contiennent des antioxydants hydrophobes, qui peuvent être obtenus à partir de la plante par macération et/ou extraction.
Ouvrages
  • [1] Ojewole J. A et al., Phytother Res. 2004, 18(8):601-8.
  • [2] Eloff J.N et al., J Ethnopharmacol. 2001, 76(3):305-8.
  • [3] Publication de brevet australien no. 2000/29790.
  • [4] Publication internationale no. WO 03/092634.
  • [5] Mdluli, K.M et Owusu-Apenten, R., Journal de biochimie alimentaire. 2003, 27: 67-82.
  • [6] Exemple E. R et al. Recherche scientifique et essai. 2006, 1(30):087-092.
  • [7] Publication internationale no. WO 06/097806.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
Bien que le fruit de marula ait été signalé comme étant riche en antioxydants, la préparation et l'utilisation d'extraits de fruit de marula dans le traitement de maladies et de troubles tels que l'athérosclérose et les maladies neurodégénératives n'ont pas été signalées jusqu'à présent.
Les résultats surprenants, divulgués ici, indiquent que les extraits préparés à partir de jus de marula sont non seulement stables pendant de longues périodes de temps mais, plus important encore, possèdent des avantages thérapeutiques différents et dans certains cas meilleurs que ceux présentés par le jus de marula non traité. Les extraits de l'invention ont démontré qu'ils affectent favorablement les lipides sanguins, comme le montrent une réduction des LDL sériques, une augmentation des HDL sériques et une atténuation du stress oxydatif sérique ; les extraits ont démontré leur efficacité dans le traitement des dommages dus au stress oxydatif, de l'athérosclérose, de la neurodégénérescence et des troubles associés.
Les extraits de jus de marula de la présente invention sont également efficaces pour prévenir la neurodégénérescence, comme en témoigne leur influence protectrice sur les cellules neuronales exposées aux dommages des radicaux libres.
La présente invention décrit également l'utilisation d'extraits de jus de marula en tant qu'antioxydants pour une utilisation dans une grande variété d'applications, par exemple, une utilisation dans des compléments alimentaires pour engendrer, par exemple, un effet anti-athérogène chez des sujets sains et non sains (humains et non-sains). animaux humains) et comme agents de traitement ou de prévention des maladies associées neurodégénératives.
Ainsi, dans un aspect de la présente invention, il est fourni un extrait dérivé du fruit de marula, à l'exclusion de la graine, ledit extrait étant obtenu par un procédé comprenant la soumission du jus recueilli du fruit de marula à une extraction avec un ou plusieurs d'un solution, un solvant organique et un mélange de ceux-ci, c'est-à-dire pour obtenir ainsi du jus de marula un extrait ayant les avantages biologiques souhaités.
Le jus de marula obtenu à partir du fruit de marula peut être filtré avant l'extraction afin d'éliminer les débris de fruits tels que les restes de graines et autres matières insolubles. La filtration peut être effectuée en utilisant n'importe quel procédé connu dans l'art pour filtrer les boissons, tel que, mais sans s'y limiter, la filtration sur diatomite (DE) et la filtration sur membrane.
Dans certains modes de réalisation, le jus de marula obtenu à partir du fruit de marula est pasteurisé avant l'extraction afin de ralentir la croissance microbienne dans le jus en réduisant le nombre d'agents pathogènes viables qu'il contient. En règle générale, la pasteurisation était effectuée en exposant le jus à des températures inférieures à l'ébullition. Dans certains modes de réalisation, la pasteurisation est réalisée par un ou plusieurs autres procédés de pasteurisation connus dans l'art, par exemple contrôlés par des agences nationales de sécurité alimentaire (telles que l'USDA aux États-Unis et la Food Standards Agency au Royaume-Uni). Certains exemples non limitatifs comprennent la pasteurisation à haute température/courte durée (HTST), la pasteurisation à durée de conservation prolongée (ESL), la pasteurisation à ultra-haute température (UHT ou ultra-thermique) et la pasteurisation par lots ou en cuve.
Le terme « extrait » tel qu'il est utilisé ici fait référence à un produit soluble dans l'eau obtenu à partir de n'importe quelle partie du fruit de marula ou de toute partie dérivée de celui-ci, à l'exclusion de la graine, mais comprenant un ou plusieurs parmi le mésocarpe, l'endocarpe, l'écorce (peau externe épaisse), et/ou la peau (exocarpe), en employant une méthode choisie parmi l'expression, l'absorption, la macération, la lyophilisation, la distillation et toute combinaison de deux ou plusieurs de ces procédés.
Les substances extraites, séparément ou en combinaison, peuvent être transformées en n'importe quelle formulation souhaitée, y compris une solution aqueuse, un solide tel qu'une poudre sèche, un granulé ou une pastille, un concentré, par exemple un semi-liquide ayant une consistance sirupeuse qui peut être obtenu par évaporation de tout ou presque tout le contenu liquide de l'extrait, ou de toute autre forme. Généralement, les méthodes d'extraction des matériaux peuvent varier mutatis mutandis selon l'âge du fruit de marula, le sous-type, la saison de récolte, la région de croissance, les substances à extraire, leur stabilité et d'autres facteurs connus de l'homme du métier.
Dans certains modes de réalisation, l'extrait de l'invention est obtenu en mettant en contact le jus de marula avec une solution aqueuse pour en extraire un ou plusieurs ingrédients ou une combinaison de ceux-ci. La « solution aqueuse » peut être, dans la plupart des termes généraux, de l'eau (dans certains modes de réalisation, de l'eau à diverses concentrations minérales naturelles) ou de l'eau distillée ou autrement purifiée (distillée ou purifiée par tout autre procédé), une solution saline aqueuse comprenant un ou plusieurs sels ou un mélange d'eau avec un ou plusieurs solvants polaires miscibles à l'eau, par exemple C1-C4 alcools et cétones.
Dans certains modes de réalisation, le solvant aqueux est un mélange d'eau et d'au moins un alcool. Dans certains autres modes de réalisation, le solvant aqueux est un mélange d'eau et d'éthanol, dans lequel le rapport eau/éthanol est de 1/1, 1/2. . . 1:5. . . 1h10. . . 1:100. . . 1:1 000. . . etc., respectivement, ou 2:1, 3:1 . . . 5:1. . . 10:1. . . 100:1. . . 1 000:1, etc., respectivement. Tout autre rapport intermédiaire est également inclus.
L'extraction peut en variante employer un solvant organique seul ou en combinaison avec un autre solvant de ce type. Dans certains modes de réalisation, le processus d'extraction est un processus en plusieurs étapes dans lequel le fruit de marula (jus) est d'abord mis en contact avec un solvant, puis avec un solvant différent afin de maximiser le rendement ou d'enrichir l'extrait avec un ou plusieurs composants souhaités.
Typiquement, le solvant organique est au moins un alcool tel que le méthanol, l'éthanol et l'alcool isopropylique, ou une cétone telle que l'acétone. Lorsque l'éthanol est utilisé, il peut être utilisé sous la forme d'une solution éthanolique aqueuse, par exemple d'environ 40 à 60 % d'éthanol. Des solutions similaires peuvent également être utilisées avec les autres solvants organiques miscibles à l'eau. L'extrait obtenu à la suite d'un extrait alcoolique est ici désigné extrait I.
Il doit être compris dans le contexte de la présente invention que l'extraction éthanolique, ou toute autre extraction décrite ici, peut être effectuée à n'importe quelle température appropriée. Il apparaîtra à l'homme de l'art qu'une extraction plus efficace se produira si le jus est agité, par exemple en remuant ou en secouant, et/ou si le mélange est chauffé à une température supérieure à la température ambiante (supérieure à 25-27 °C .). Des températures d'extraction inférieures, telles que celles inférieures à la température ambiante, peuvent également être utilisées. Dans certains modes de réalisation, le procédé d'extraction est réalisé à température ambiante ou à une température comprise entre 25 et 30°C.
Il faut également comprendre dans le contexte de la présente invention que l'extraction peut être effectuée pendant n'importe quelle durée commode.
L'homme du métier reconnaîtra en outre que le procédé d'obtention de l'extrait de l'invention peut impliquer la macération du fruit de marula pour obtenir des morceaux plus petits du fruit entier à partir desquels des extraits peuvent être obtenus par une ou plusieurs autres méthodes d'extraction, telles que distillation. En variante, l'extrait peut être obtenu par expression, à savoir par pressage du jus du fruit.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, avant la mise en contact du jus avec un ou plusieurs solvants comme décrit, le fruit, c'est-à-dire le fruit entier, à l'exclusion de la graine, ou toute partie de celui-ci, peut être prétraité par macération, expression ou tout autre procédé.
Le jus obtenu à partir du fruit de marula peut être stocké avant l'extraction ou le prétraitement, par exemple le séchage, pendant des périodes de temps prolongées. Le stockage peut se faire à n'importe quelle température et condition, dans lesquelles la fraîcheur du jus est maintenue et la dégradation est empêchée ou minimisée. Ces températures peuvent être supérieures ou inférieures à la température ambiante. Dans certains modes de réalisation, le jus peut être conservé au réfrigérateur pendant plusieurs semaines ou au congélateur pendant plusieurs années. Lorsque la congélation du jus est employée, le procédé peut en outre comprendre l'étape de décongélation du jus avant l'extraction ou le traitement.
Le séchage du jus peut être réalisé en chauffant le jus liquide sous vide, ou sous pression atmosphérique, à une température préréglée qui peut être la température ambiante ou au-dessus de la température ambiante, en un seul lot ou en plus petites quantités afin de contrôler la teneur en humidité de l'extrait. Dans un exemple non limitatif décrit ici, le séchage est réalisé en versant le jus sur une surface telle qu'un plateau, dans certains cas recouvert d'une feuille (par exemple, une feuille d'aluminium) pour chauffer uniformément le jus et obtenir une couche sensiblement uniforme. d'extrait de marula séché.
Le concentré humide (sirop) obtenu par séchage est de couleur jaunâtre à brun foncé, selon la concentration et le type d'extrait. Le matériau séché est facilement pulvérisé et a une couleur or brillant à brun foncé selon le type d'extrait. La matière séchée est soluble dans l'eau.
L'extrait de marula qui est ensuite obtenu contient des quantités variables de matière volatile, les quantités dépendant de la durée de la période de séchage et de la température utilisée. Sans vouloir être lié par la théorie, lors de l'élimination des composants volatils, le concentré, à savoir dans certains modes de réalisation, l'extrait en poudre, contient par rapport au jus de fruit entier une concentration plus élevée de composants actifs dont la présence et la combinaison fournissent l'activité élevée qui n'est pas observé dans le fruit entier et qui est démontré ici.
Ainsi, l'extrait est obtenu par un procédé comprenant la mise en contact du jus de marula avec un solvant aqueux tel que défini pour obtenir une suspension à partir de laquelle un extrait liquide peut être séparé.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprenant :
  • (i) recueillir le jus du fruit de marula ;
  • (ii) la mise en contact dudit jus avec un ou plusieurs parmi une solution aqueuse, un solvant organique polaire miscible à l'eau et un mélange de ceux-ci pour obtenir une suspension ; et
  • (iii) séparer de ladite suspension un extrait liquide.
Dans certains modes de réalisation, le jus collecté est séché ou prétraité comme décrit avant l'extraction.
Dans d'autres modes de réalisation, la séparation de l'extrait liquide de l'étape (iii) peut se faire par centrifugation de la suspension obtenue à l'étape (ii) pour séparer l'extrait liquide sous forme de surnageant d'une masse solide.
Dans certains autres modes de réalisation, le procédé comprend :
  • (i) recueillir le jus du fruit de marula ;
  • (ii) sécher le jus en un solide ou un semi-solide ;
  • (ii) la mise en contact du jus séché ou semi-séché obtenu à l'étape (ii) avec un ou plusieurs parmi une solution aqueuse, un solvant organique et un mélange de ceux-ci pour obtenir une suspension ; et
  • (iii) centrifuger éventuellement la suspension pour séparer un extrait liquide d'une masse solide.
Dans d'autres modes de réalisation, le procédé comprenant :
  • (i) fournir du jus à partir du fruit de marula, ledit jus étant sous une forme choisie parmi le jus frais entier, le jus entier stocké, le jus pasteurisé, le jus séché et le jus semi-séché ;
  • (ii) la mise en contact du jus avec un ou plusieurs parmi une solution aqueuse, un solvant organique et un mélange de ceux-ci pour obtenir une suspension ; et
  • (iii) centrifuger éventuellement la suspension pour séparer un extrait liquide d'une masse solide.
Dans certains autres modes de réalisation, le procédé comprenant :
  • (i) fournir du jus à partir du fruit de marula, ledit jus étant sous une forme choisie parmi le jus frais entier, le jus entier stocké, le jus pasteurisé, le jus séché et le jus semi-séché ;
  • (ii) la mise en contact du jus avec un ou plusieurs parmi une solution aqueuse, un solvant organique et un mélange de ceux-ci pour obtenir une suspension ; et
  • (iii) séparer un extrait liquide d'une masse solide.
Il convient de noter que la séparation de l'extrait liquide peut être répétée plus d'une fois, avec une seconde quantité du même solvant ou d'un solvant différent, et les surnageants obtenus à chaque étape peuvent être combinés et traités ultérieurement pour isoler, concentrer ou traiter ultérieurement le extrait. Ainsi, deux surnageants ou plus peuvent être combinés et le solvant et/ou une partie de l'eau peuvent être éliminés, par exemple en utilisant n'importe quel procédé d'élimination du solvant.
Lorsque le fruit de départ comprend une matière solide ou dans les cas où le fruit de marula a été transformé en poudre séchée ou semi-séchée ou sous forme de granulés, l'extrait peut être séparé au moins en une phase solide et une phase aqueuse, chaque phase ayant l'activité biologique telle que décrite ici.
L'extrait de l'invention, obtenu en employant un ou plusieurs procédés tels que décrits ici, peut être caractérisé par un ou plusieurs des éléments suivants :
    • 1. haute stabilité à température ambiante pendant de longues périodes ;
    • 2. peut être mis sous diverses formes, y compris une forme liquide, solide ou semi-solide ;
    • 3. peut être transformé en une solution avec une grande variété d'additifs ;
    • 4. peut être formé comme complément nutritionnel pour la consommation humaine ;
    • 5. a une large gamme d'activités biologiques par rapport au jus d'origine, comme décrit plus en détail ici ; et
    • 6. a une capacité antioxydante FRAP (Ferric-Reducing Antioxidant Power) supérieure à celle du jus d'origine.
Ainsi, l'invention propose également un extrait de marula caractérisé par une capacité antioxydante FRAP d'au minimum 1 000 et 1 500 mg d'équivalents vitamine C pour 100 ml. Cela se compare au FRAP mesuré pour le jus de marula non traité entre 260 et 600 mg de vitamine C pour 100 ml. en d'autres termes, la capacité FRAP d'un extrait selon l'invention est comprise entre 2 et 3 fois l'activité observée dans le jus d'origine non traité.
Dans certains modes de réalisation, l'extrait ayant la capacité FRAP ci-dessus est l'extrait I.
La présente invention propose également un extrait ayant une fraction polyphénolique appauvrie, ledit extrait étant désigné ici extrait II. La fraction polyphénolique, ici en tant qu'extrait III, peut être séparée du jus de marula, par exemple par chromatographie du jus de marula pour fournir l'extrait II (appauvri) et l'extrait III (fraction phénolique séparée). Dans certains modes de réalisation, l'appauvrissement de la fraction polyphénolique est obtenu par un procédé comprenant la filtration du jus de marula, par exemple en faisant passer le jus à travers une ou plusieurs couches d'étamine (de différentes qualités, par exemple, du tissage ouvert au tissage extra-fin utilisé selon la qualité et la quantité du jus), centrifugation facultative du jus filtré pour éliminer les débris de fruits, application du jus clair à la chromatographie, par exemple, chromatographie sur colonne à l'aide de colonnes remplies de résines échangeuses d'ions et adsorbantes Sepabeads, ou C18-de la silice ou des résines liées pour l'interaction hydrophobe et la chromatographie en phase inverse, en recueillant les fractions et en combinant les fractions ayant le même total de solides solubles (TSS).
Dans certains modes de réalisation, la fraction polyphénol peut être collectée à partir du milieu utilisé pour la chromatographie, par exemple à partir des billes de la colonne, en mélangeant le milieu, par exemple les billes, avec une solution alcoolique (éthanol, méthanol, etc.). Les fractions alcooliques peuvent être ensuite réunies et évaporées à sec.
Selon certains modes de réalisation, afin d'obtenir un extrait avec un rapport polyphénols/vitamine C accru, la fraction polyphénolique (c'est-à-dire l'extrait III) peut être séparée du jus puis ajoutée à la fraction appauvrie en polyphénols (c'est-à-dire l'extrait II) . Dans certains autres modes de réalisation, l'extrait II est combiné avec l'extrait I.
Dans certains modes de réalisation, l'extrait II est caractérisé par une capacité antioxydante FRAP d'au moins entre 250 et 500 mg d'équivalents vitamine C pour 100 ml.
Tels qu'utilisés ici, les « polyphénols » désignent un groupe de substances, caractérisé par la présence de plus d'une unité phénolique ou bloc de construction par molécule. Les polyphénols sont généralement divisés en tanins hydrolysables (esters d'acide gallique de glucose et d'autres sucres) et en phénylpropanoïdes, tels que les lignines, les flavonoïdes et les tanins condensés. Dans certains modes de réalisation, les polyphénols obtenus à partir du jus de macula comprennent des tanins hydrolysables, des catéchines et des acides hydroxycinnamiques et/ou leurs dérivés.
Dans un autre de ses aspects, la présente invention propose l'utilisation d'au moins un extrait de l'invention pour la préparation d'une composition.
Dans certains modes de réalisation, la composition est une composition pharmaceutique.
Dans d'autres modes de réalisation, l'extrait est l'ingrédient actif présent dans la composition avec un support, diluant ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
Le choix d'un support sera déterminé en partie par l'extrait particulier, ainsi que par la méthode particulière utilisée pour administrer la composition le comprenant. En conséquence, il existe une grande variété de formulations appropriées de la composition pharmaceutique de la présente invention. Les formulations suivantes pour l'administration orale, en aérosol, parenterale, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapératonéale, rectale et vaginale sont simplement exemplaires et ne sont en aucun cas limitatives.
Les formulations appropriées pour l'administration orale peuvent consister en (a) des solutions liquides, telles qu'une quantité efficace de l'extrait dissous dans des diluants, tels que de l'eau, une solution saline ou du jus d'orange ; (b) gélules, sachets, comprimés, pastilles et pastilles, contenant chacun une quantité prédéterminée de l'extrait, sous forme de solides ou de granulés ; (c) poudres; (d) des suspensions dans un liquide approprié ; et (e) des émulsions appropriées. Les formulations liquides peuvent comprendre des diluants, tels que l'eau et des alcools, par exemple l'éthanol, l'alcool benzylique et les polyéthylènealcools, avec ou sans l'addition d'un tensioactif, d'un agent de suspension ou d'un agent émulsifiant pharmaceutiquement acceptable. Les formes de gélule peuvent être du type gélatine à enveloppe dure ou molle ordinaire contenant, par exemple, des tensioactifs, des lubrifiants et des charges inertes, telles que le lactose, le saccharose, le phosphate de calcium et l'amidon de maïs. Les formes de comprimés peuvent inclure un ou plusieurs parmi le lactose, le saccharose, le mannitol, l'amidon de maïs, l'amidon de pomme de terre, l'acide alginique, la cellulose microcristalline, l'acacia, la gélatine, la gomme de guar, le dioxyde de silicium colloïdal, la croscarmellose sodique, le talc, le stéarate de magnésium, le stéarate de calcium, le stéarate de zinc , l'acide stéarique et d'autres excipients, colorants, diluants, tampons, désintégrants, humidifiants, conservateurs, aromatisants et supports pharmacologiquement compatibles. Les formes de pastilles peuvent comprendre l'ingrédient actif dans un arôme, généralement du saccharose et de l'acacia ou de la gomme adragante, ainsi que des pastilles comprenant l'ingrédient actif dans une base inerte, telle que de la gélatine et de la glycérine, ou du saccharose et de l'acacia, des émulsions, des gels et similaires contenant , en plus de l'extrait, des supports tels que connus dans l'art.
Les extraits ou compositions de la présente invention, par exemple une composition pharmaceutique, seuls ou en combinaison avec d'autres composants appropriés peuvent être transformés en formulations d'aérosol à administrer par inhalation. Ces formulations d'aérosol peuvent être placées dans des propulseurs acceptables sous pression, tels que le dichlorodifluorométhane, le propane, l'azote, etc. Ils peuvent également être formulés en tant que produits pharmaceutiques pour des préparations sans pression, comme dans un nébuliseur ou un atomiseur.
Les formulations convenant à l'administration parentérale comprennent des solutions injectables stériles aqueuses et non aqueuses, isotoniques, qui peuvent contenir des antioxydants, des tampons, des bactériostatiques et des solutés qui rendent la formulation isotonique avec le sang du receveur prévu, et des solutions stériles aqueuses et non aqueuses des suspensions qui comprennent des agents de suspension, des solubilisants, des épaississants, des stabilisants et des conservateurs. Le composé peut être administré dans un diluant physiologiquement acceptable dans un support pharmaceutique, tel qu'un liquide stérile ou un mélange de liquides, comprenant de l'eau, une solution saline, du dextrose aqueux et des solutions de sucre apparentées, un alcool, tel que l'éthanol, l'isopropanol ou l'alcool hexadécylique, les glycols, comme le propylène glycol ou le polyéthylène glycol, les cétals de glycérol, comme le 2,2-diméthyl-1,3-dioxolane-4-méthanol, les éthers, comme le poly(éthylèneglycol) 400, une huile, un acide gras, un ester ou glycéride d'acide, ou un glycéride d'acide gras acétylé avec ou sans addition d'un tensioactif pharmaceutiquement acceptable, tel qu'un savon ou un détergent, un agent de suspension, tel que la pectine, des carbomères, la méthylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose ou la carboxyméthylcellulose, ou des agents émulsifiants et autres adjuvants pharmaceutiques.
Les huiles, qui peuvent être utilisées dans des formulations parentérales, comprennent les huiles de pétrole, animales, végétales ou synthétiques. Des exemples spécifiques d'huiles comprennent l'arachide, le soja, le sésame, la graine de coton, le maïs, l'olive, la vaseline et les huiles minérales. Des acides gras appropriés pour une utilisation dans des formulations parentérales comprennent l'acide oléique, l'acide stéarique et l'acide isostéarique. L'oléate d'éthyle et le myristate d'isopropyle sont des exemples d'esters d'acides gras appropriés. Les savons appropriés pour une utilisation dans les formulations parentérales comprennent les sels gras de métaux alcalins, d'ammonium et de triéthanolamine, et les détergents appropriés comprennent (a) les détergents cationiques tels que, par exemple, les halogénures de diméthyldialkylammonium et les halogénures d'alkylpyridinium, (b) les détergents anioniques tels que , par exemple, les sulfonates d'alkyle, d'aryle et d'oléfine, les sulfates d'alkyle, d'oléfine, d'éther et de monoglycéride et les sulfosuccinates, (c) les détergents non ioniques tels que, par exemple, les oxydes d'amines grasses, les alcanolamides d'acides gras et les copolymères polyoxyéthylènepolypropylène, (d) les détergents amphotères tels que, par exemple, les alkyl-β-aminopriopionates et les sels d'ammonium quaternaire de 2-alkyl-imidazoline, et (3) leurs mélanges.
Les formulations parentérales contiennent typiquement d'environ 0,5 à environ 25 % en poids de l'extrait en solution. Des conservateurs et des tampons appropriés peuvent être utilisés dans de telles formulations. Afin de minimiser ou d'éliminer l'irritation au site d'injection, de telles compositions peuvent contenir un ou plusieurs tensioactifs non ioniques ayant une balance hydrophile-lipophile (HLB) d'environ 12 à environ 17. La quantité de tensioactif dans de telles formulations varie d'environ 5 à environ 15 % en poids. Les tensioactifs appropriés comprennent les esters d'acides gras de polyéthylène sorbitan, tels que le monooléate de sorbitan et les produits d'addition de poids moléculaire élevé d'oxyde d'éthylène avec une base hydrophobe, formés par la condensation d'oxyde de propylène avec du propylène glycol. Les formulations parentérales peuvent être présentées dans des récipients scellés à doses unitaires ou multidoses, tels que des ampoules et des flacons, et peuvent être stockées dans un état lyophilisé (lyophilisé) ne nécessitant que l'ajout du support liquide stérile, par exemple, de l'eau. , pour injections, immédiatement avant utilisation. Des solutions et suspensions injectables extemporanées peuvent être préparées à partir de poudres, granulés et comprimés stériles du type décrit précédemment.
Les extraits et compositions de la présente invention peuvent être transformés en formulations injectables. Les exigences pour des supports pharmaceutiques efficaces pour des compositions injectables sont bien connues de l'homme du métier. Voir Pharmacie et pratique de la pharmacie, J.B. Lippincott Co., Philadelphie, Pennsylvanie, Banker et Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), et Manuel de l'ASHP sur les médicaments injectables, Dans un autre, 4e éd., pages 622-630 (1986).
De plus, les extraits de la présente invention peuvent être transformés en suppositoires par mélange avec une variété de bases, telles que des bases émulsifiantes ou des bases solubles dans l'eau. Les formulations appropriées pour l'administration vaginale peuvent être présentées sous forme de pessaires, tampons, crèmes, gels, pâtes, mousses ou formules de pulvérisation contenant, en plus de l'ingrédient actif, des véhicules connus dans l'art comme étant appropriés.
Comme indiqué ci-dessus, les extraits et compositions de l'invention peuvent être fabriqués, présentés et/ou stockés sous toute forme, à savoir sous forme de liquide, de concentré, de poudre sèche, de solution, d'émulsion, ou de solution mère ou un concentré d'actions.
Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique est destinée au traitement ou à la prévention d'au moins une maladie ou un trouble associé à des dommages dus au stress oxydatif.
Le stress oxydatif est le résultat d'un déséquilibre de l'homéostasie pro-oxydant/antioxydant qui conduit à la génération d'espèces réactives toxiques de l'oxygène. Les radicaux libres se forment lorsque l'oxygène interagit avec certaines molécules et déclenche une réaction en chaîne de dommages parmi les composants cellulaires importants. Ainsi, l'inflammation et les processus oxydatifs sont interconnectés. De plus, le stress oxydatif peut induire une cytotoxicité des cellules sanguines, stimuler la libération de cytokines inflammatoires et induire la production de facteurs de croissance. Le stress oxydatif joue un rôle essentiel dans la formation des plaques et, avec l'inflammation vasculaire inhérente, peut être un puissant prédicteur de l'athérosclérose.
Ainsi, tel qu'il est utilisé ici, le terme "dommage dû au stress oxydatif" fait référence à un dommage aux cellules, tissus et/ou organes d'un animal, y compris l'homme, qui est causé par un déséquilibre entre la production d'oxygène réactif et la capacité d'un système biologique à détoxifier les intermédiaires réactifs ou réparer facilement les dommages qui en résultent. Le plus souvent, les perturbations de cet état redox normal peuvent provoquer des effets toxiques par la production de peroxydes et de radicaux libres qui endommagent tout ou certains composants de la cellule, notamment les protéines, les lipides et l'ADN.
Dans certains modes de réalisation, les dommages dus au stress oxydatif sont associés à un trouble ou une maladie choisie parmi l'athérosclérose, la maladie de Parkinson, l'insuffisance cardiaque, l'infarctus du myocarde, les maladies ou troubles neurodégénératifs, la maladie oculaire, le syndrome de fatigue chronique et autres.
L'athérosclérose, principale cause de morbidité et de mortalité chez les personnes au mode de vie occidental, se développe en raison de divers facteurs de risque. L'hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur d'athérosclérose et la réduction de la concentration plasmatique de cholestérol par un traitement médicamenteux réduit l'incidence cardiovasculaire. La lésion athérosclérotique est caractérisée par un stress oxydatif accéléré et la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui attaquent les lipides dans les lipoprotéines, ainsi que dans les macrophages artériels. La modification oxydative des lipoprotéines de basse densité (LDL) joue un rôle clé dans la pathogenèse de l'athérosclérose. Le LDL oxydé (Ox-LDL) est un contributeur majeur au développement des lésions athéroscléreuses, car il stimule l'accumulation de cholestérol macrophage et la formation de cellules spumeuses. Contrairement à l'athérogénicité des LDL, les taux sériques de lipoprotéines de haute densité (HDL) sont inversement liés au risque d'athérosclérose. Le HDL exerce un effet inhibiteur sur l'oxydation des LDL et cet effet peut être lié à son enzyme associée, la paraoxonase 1 (PON1).
L'athérosclérose est également le processus ou le trouble impliquant l'accumulation de plaque à l'intérieur des artères, y compris celles du cœur, du cerveau, des bras, des jambes et du bassin. Ainsi, le terme peut également faire référence à l'accumulation progressive de cellules musculaires lisses, de cellules immunitaires (par exemple, les lymphocytes, les macrophages ou les monocytes), de produits lipidiques (par exemple, les lipoprotéines ou le cholestérol), de déchets cellulaires, de calcium ou d'autres substances dans le corps. paroi interne d'une artère, entraînant le rétrécissement ou l'obstruction du vaisseau sanguin et le développement de maladies associées à l'athérosclérose.
Comme l'athérosclérose se manifeste dans les grandes et moyennes artères, le traitement ou la prévention affecte souvent le développement d'un état d'inflammation chronique dans les artères.
L'extrait de l'invention convient donc également pour le traitement et la prévention d'états comprenant l'athérosclérose des artères coronaires provoquant une coronaropathie, un infarctus du myocarde, une thrombose coronarienne et une angine de poitrine ; l'athérosclérose des artères alimentant le système nerveux central provoquant des accidents vasculaires cérébraux et une ischémie cérébrale transitoire ; athérosclérose de la circulation périphérique provoquant une claudication intermittente et une gangrène ; athérosclérose d'une artère de la circulation splanchnique provoquant une ischémie mésentérique ; et la sténose de l'artère rénale.
Ainsi, la composition de l'invention est en outre appropriée pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'au moins une maladie ou un trouble associé à une ou plusieurs des concentrations sériques accrues de triglycérides lipidiques, des concentrations sériques de cholestérol et des concentrations sériques de cholestérol total et LDL et une diminution de HDL- concentrations de cholestérol.
Tel qu'utilisé ici, une telle maladie ou un tel trouble associé à une augmentation des concentrations sériques de triglycérides lipidiques, des concentrations sériques de cholestérol et des concentrations sériques de cholestérol total et LDL et à une diminution des concentrations de cholestérol HDL, implique des taux de cholestérol anormalement élevés (hypercholestérolémie) et/ou des taux élevés de LDL ou des triglycérides et/ou des concentrations plus faibles de HDL fonctionnel, telles que les maladies coronariennes ou d'autres formes de maladies cardiovasculaires ainsi que des maladies ou des troubles qui impliquent le développement d'athérome dans les artères (c'est-à-dire l'athérosclérose), tels que l'hypocholestérolémie, les maladies vasculaires périphériques, le diabète et hypertension artérielle.
Le stress oxydatif a également été lié à la mort des cellules neuronales associée à diverses conditions neurodégénératives. Les maladies neurodégénératives sont des conditions dans lesquelles les cellules du cerveau et de la moelle épinière sont perdues. Normalement, la neurodégénérescence commence bien avant que le patient ne présente des symptômes. Comme les cellules cérébrales sont continuellement exposées aux espèces réactives de l'oxygène générées par le métabolisme oxydatif, le stress oxydatif est également l'un des facteurs prédisposants aux troubles neurologiques chez l'adulte et a été impliqué dans la pathogenèse de certains de ces troubles tels que la maladie de Parkinson.
L'extrait ou la composition de l'invention est également utilisé pour le traitement ou la prévention d'au moins une maladie ou trouble neurodégénératif associé.
Les « maladies ou troubles neurodégénératifs », dans le contexte de la présente invention, désignent une ou plusieurs affections dans lesquelles des cellules du cerveau et de la moelle épinière sont perdues en raison de la détérioration des neurones ou de leur gaine de myéline qui, avec le temps, entraîne un dysfonctionnement. et les handicaps qui en découlent. Ainsi, les maladies ou troubles neurodégénératifs sont ceux relatifs à des affections entraînant des troubles du mouvement, telles que l'ataxie, ainsi qu'à des affections affectant la mémoire et liées à la démence. Certains exemples non limitatifs de maladies ou de troubles neurodégénératifs comprennent l'alcoolisme, la maladie d'Alexander, la maladie d'Alper, la maladie d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique (maladie de Lou Gehrig), l'ataxie télangiectasie, la maladie de Batten (également connue sous le nom de maladie de Spielmeyer-Vogt-Sjögren-Batten), encéphalopathie spongiforme bovine (ESB), maladie de Canavan, paralysie cérébrale, syndrome de Cockayne, dégénérescence corticobasale, maladie de Creutzfeldt-Jakob, dégénérescence lobaire frontotemporale, maladie de Huntington, démence associée au VIH, maladie de Kennedy, maladie de Krabbe, démence à corps de Lewy, neuroborréliose, Machado- Maladie de Joseph (ataxie spinocérébelleuse de type 3), atrophie multisystématisée, sclérose en plaques, narcolepsie, maladie de Niemann Pick, maladie de Parkinson, maladie de Pelizaeus-Merzbacher, maladie de Pick, sclérose latérale primitive, maladies à prions, paralysie supranucléaire progressive, maladie de Refsum, maladie de Sandhoff, la maladie de Childer, la dégénérescence combinée subaiguë de la moelle épinière secondaire à une anémie pernicieuse, l'ataxie spinocérébelleuse, l'amyotrophie spinale, la maladie de Steele-Richardson-Olszewski et le tabès dorsal.
Dans encore un autre de ses aspects, la présente invention propose une méthode pour le traitement ou la prévention d'au moins une maladie ou un trouble associé à des dommages de stress oxydatif chez un mammifère, comprenant l'administration audit mammifère d'une quantité efficace d'un extrait selon l'invention. ou une composition pharmaceutique le comprenant.
Dans un aspect supplémentaire de la présente invention, il est fourni un procédé pour le traitement ou la prévention d'au moins une maladie ou un trouble associé à une ou plusieurs parmi des concentrations sériques accrues de triglycérides lipidiques, des concentrations sériques de cholestérol et des concentrations sériques de cholestérol total et LDL et une diminution de HDL -cholestérol chez un mammifère, comprenant l'administration audit mammifère d'une quantité efficace d'un extrait selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique en comprenant.
Dans un autre de ses aspects, la présente invention propose une méthode pour le traitement ou la prévention d'au moins une maladie ou un trouble neurodégénératif associé chez un mammifère comprenant l'administration audit mammifère d'une quantité efficace d'un extrait selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique comprenant de celui-ci.
Dans encore un autre aspect, la présente invention fournit un antioxydant comprenant l'extrait de l'invention.
Dans encore un autre aspect, la présente invention fournit un agent réducteur de cholestérol comprenant l'extrait de l'invention.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « traiter et/ou prévenir » se réfère à l'administration d'une quantité thérapeutique de la composition de la présente invention qui est efficace pour améliorer les symptômes indésirables associés à une maladie, pour prévenir la manifestation de tels symptômes avant qu'ils n'apparaissent, pour ralentir la progression de la maladie, pour ralentir la détérioration des symptômes, pour favoriser l'apparition de la période de rémission, pour ralentir les dommages irréversibles causés au stade chronique progressif de la maladie, pour retarder l'apparition de ladite stade progressif, pour atténuer la gravité ou guérir la maladie, pour améliorer le taux de survie ou une récupération plus rapide, ou pour prévenir l'apparition de la forme de la maladie ou une combinaison de deux ou plusieurs des éléments ci-dessus.
Un extrait ou une composition de l'invention peut être administré par toute méthode connue de l'homme du métier. Typiquement, l'administration d'un extrait ou d'une composition pharmaceutique le comprenant est d'une quantité efficace du ou des extrait(s) compris dans la composition. La « quantité efficace » aux fins des présentes est déterminée par des considérations connues dans l'art. La quantité doit être efficace pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité tel que décrit ci-dessus, en fonction, entre autres, du type et de la gravité de la maladie à traiter et du régime de traitement. La quantité efficace est typiquement déterminée dans des essais cliniques conçus de manière appropriée (par exemple, des études de plage de doses) et la personne versée dans l'art saura comment mener correctement de tels essais afin de déterminer la quantité efficace. Comme on le sait généralement, une quantité efficace dépend d'une variété de facteurs, y compris l'affinité du ligand pour le récepteur, son profil de distribution dans le corps, une variété de paramètres pharmacologiques tels que la demi-vie dans le corps, des effets secondaires indésirables, si quelconque, sur des facteurs tels que l'âge et le sexe, etc.
L'extrait de l'invention peut également être utilisé pour préparer une composition à utiliser dans une variété d'applications non pharmaceutiques. Dans certains modes de réalisation, la composition est une composition anti-oxydante destinée à être utilisée comme conservateur pour une grande variété d'applications dans l'industrie alimentaire, l'industrie cosmétique, la thérapeutique, etc., et pour l'inhibition de l'oxydation des LDL induite par les ions cuivre in vitro ou invivo.
L'extrait décrit ici peut en outre être utilisé comme complément nutritionnel ou comme composant actif d'un tel complément. Dans certains modes de réalisation, le supplément est adapté à la consommation à la fois par des humains et des animaux non humains, pour la gestion du bien-être, et le traitement et la prévention d'états et de troubles associés à des dommages oxydatifs.
Dans le contexte de la présente invention, le complément nutritionnel, selon sa nature et sa forme physique, par exemple de nature lipophile ou hydrophile, peut en outre comprendre un ou plusieurs émulsifiants, stabilisants, antioxydants et autres additifs. On utilise des émulsifiants compatibles avec l'alimentation tels que les phospholipides, par exemple la lécithine, le mono- ou tristéarate de polyoxyéthylène sorbitan, le monolaurate, le monopalmitate, le mono- ou trioléate, un mono- ou diglycéride. Ces émulsifiants, stabilisants, antioxydants et additifs peuvent être ajoutés à l'extrait de l'invention selon l'utilisation finale dudit extrait.
Le complément nutritionnel décrit ici peut également contenir des bioactifs synthétiques ou naturels tels que des acides aminés, des acides gras, des vitamines, des minéraux, des polyphénols, etc., qui peuvent être ajoutés soit par voie sèche soit par mélange humide à ladite composition avant pasteurisation et/ou séchage.
Dans certains modes de réalisation, le complément nutritionnel est une formule nutritionnelle complète, un produit laitier, une boisson réfrigérée ou de longue conservation, une eau minérale ou purifiée, une boisson liquide, une soupe, un complément alimentaire, un substitut de repas, une barre nutritionnelle, un confiserie, un lait ou un produit laitier fermenté, un yaourt, une poudre à base de lait, un produit de nutrition entérale, une préparation pour nourrissons, un produit de nutrition infantile, un produit céréalier ou un produit à base de céréales fermentées, une glace, un chocolat, café, un produit culinaire tel que la mayonnaise, la purée de tomates ou des vinaigrettes ou un aliment pour animaux de compagnie. Selon ces modes de réalisation, l'extrait de l'invention peut être dispersé dans les aliments ou boissons de manière à avoir un apport journalier en nutriments bioactifs, qui dépend principalement du type d'aliment dans lequel l'extrait est dispersé, de l'effet recherché et du tissu cible . La quantité de complément alimentaire à consommer par l'individu pour obtenir un effet bénéfique dépendra également d'un ou plusieurs facteurs divers tels que le type de complément et/ou d'aliment et l'âge et le poids du consommateur.
Le complément nutritionnel pour administration orale peut se présenter sous forme de gélules, de gélules, de capsules molles, de comprimés, de comprimés dragéifiés, de pilules, de pâtes ou de pastilles, de gommes, de solutions ou d'émulsions buvables, de sirop ou de gel, dosés d'environ 0,1 à 100% de l'extrait de l'invention, qui peut ensuite être pris directement avec de l'eau ou par tout autre moyen connu. Ce complément peut également comprendre un édulcorant, un stabilisant, un antioxydant, un additif, un arôme ou un colorant.
Il est apprécié que certaines caractéristiques de l'invention, qui sont, pour plus de clarté, décrites dans le contexte de modes de réalisation séparés, peuvent également être fournies en combinaison dans un seul mode de réalisation. Inversement, diverses caractéristiques de l'invention, qui sont, par souci de brièveté, décrites dans le contexte d'un seul mode de réalisation, peuvent également être fournies séparément ou dans toute sous-combinaison appropriée ou comme approprié dans tout autre mode de réalisation décrit de l'invention. Certaines caractéristiques décrites dans le contexte de divers modes de réalisation ne doivent pas être considérées comme des caractéristiques essentielles de ces modes de réalisation, sauf si le mode de réalisation est inopérant sans ces éléments.
Tels qu'utilisés ici, le procédé, l'extrait ou les compositions de l'invention peuvent inclure des étapes ou des ingrédients ou des parties supplémentaires, uniquement si les étapes, ingrédients ou parties supplémentaires ne modifient pas les caractéristiques fondamentales et nouvelles du procédé, de l'extrait et des compositions revendiqués. Telles qu'utilisées ici, les formes singulières « un », « une » et « le » incluent des références au pluriel, sauf si le contexte dicte clairement le contraire.
DESCRIPTION BRÈVE DES DESSINS
Afin de comprendre l'invention et de voir comment elle peut être réalisée en pratique, des modes de réalisation vont maintenant être décrits, à titre d'exemples non limitatifs uniquement, en référence aux dessins annexés, dans lesquels :
FIGUE. 1 montre les concentrations de polyphénols dans les extraits de jus de marula.
FIGUES. 2A-D montre les chromatogrammes HPLC, à 270 (vert) et 330 (bleu) nm, obtenus dans le méthanol de l'extrait I (FIGUE. 2A), extrait II (FIGUE. 2B), extrait III (FIGUE. 2C) et jus de marula (FIGUE. 2D). Les pics correspondant aux tanins (T) et aux acides phénoliques (PA) sont numérotés.
FIGUES. 3A et 3B montrent la capacité de piégeage des radicaux libres des extraits de jus de marula à 1 μL/ml (figue. 3A) et 2 μL/ml (FIGUE. 3B).
FIGUES. 4A et 4B montrent la capacité d'inhibition de l'oxydation des LDL induite par les ions cuivre des extraits par rapport au jus de marula (FIG. 4A—TBARS ; FIGUE. 4B-Peroxydases lipidiques).
FIGUES. 5A et 5B montrent la capacité d'inhibition de l'oxydation des LDL induite par les ions cuivre des extraits par rapport au jus de marula : IC50 analyse (fig. 5A—TBARS ; FIGUE. 5B-Peroxydases lipidiques).
FIGUE. 6 démontre la capacité de réduire le stress oxydatif des macrophages.
FIGUE. 7 montre l'effet des extraits de jus de marula sur l'absorption des LDL par les macrophages.
FIGUE. 8 montre l'effet des extraits de jus de marula sur l'absorption d'Ox-LDL par les macrophages.
FIGUE. 9 montre l'effet des extraits de jus de marula sur l'efflux de cholestérol médié par les HDL à partir des macrophages.
FIGUE. dix montre l'effet des extraits de jus de marula sur la biosynthèse du cholestérol dans les macrophages.
FIGUE. 11 montre le pourcentage de cytotoxicité mesurée pour les astrocytes traités avec différentes concentrations des jus/extraits, 2 h avant ou en concomitance avec H2O2 addition (Jus A-jus de marula, Jus B-extrait I, Jus C-extrait II+extrait III). Les résultats sont la moyenne ± SD d'une expérience réalisée en tétraplicats.
FIGUE. 12 montre le pourcentage de cytotoxicité mesurée pour les astrocytes préincubés avec plusieurs concentrations d'extrait I (B) pendant 2h ou 6h avant l'insulte oxydative.
FIGUE. 13 montre le pourcentage de cytotoxicité mesurée pour les astrocytes préincubés avec deux concentrations de jus de marula (A) et d'extrait I (B) pendant 2 h ou 6 h avant l'insulte oxydative. Les résultats sont la moyenne ± SD d'une expérience réalisée en tétraplicats.
FIGUES. 14A-B montre les effets antioxydants du jus de marula in vitro (FIG. 14A-Formation de peroxyde lipidique ; FIGUE. 14B - Dosage FRAP).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Divers modes de réalisation et aspects de la présente invention tels que définis ci-dessus et tels que revendiqués dans la section des revendications ci-dessous trouvent un support expérimental dans les exemples suivants.
1. Séchage du jus de marula
Les fruits de marula ont été récoltés sur le sol dans les 10 jours suivant la chute des fruits des arbres et ont ensuite été pressés par une presse hydraulique sous 35 bars (presse à olives Enorossi modèle 250). Le jus a été collecté et stocké congelé à -20°C pendant différentes périodes jusqu'à 3 ans. Immédiatement avant le séchage, le jus a été décongelé et versé sur des plateaux en aluminium, pour former une couche uniforme de 0,7 cm d'épaisseur. Les barquettes contenant le jus ont été placées dans une étuve sous vide (Tuttnauer, four dry sterilizer modèle 11-900), réglée à 57°C et -760 mm de mercure, pendant une durée de 3 jours. Après séchage, contenant environ 1 % d'humidité, la substance solide a été broyée, pour donner une poudre, facilement soluble dans l'eau. La poudre a été conservée dans un dessiccateur, à température ambiante, pendant plusieurs mois.
2. Préparations d'extrait de marula
A. Extrait éthanolique (ci-après dénommé « extrait I »)
Pour préparer l'extrait I, 15 grammes de jus de marula séché ont été réduits en poudre, mis en suspension dans 50 ml d'éthanol à 50 % et placés sur un agitateur pendant 20 min. La suspension a été centrifugée et le surnageant transféré dans un ballon rond. L'étape a été répétée avec 25 ml supplémentaires d'éthanol à 50 %. Les deux surnageants ont été combinés et l'éthanol et une partie de l'eau ont été éliminés à l'aide d'un évaporateur rotatif. La solution aqueuse finale de 30 ml avait une capacité antioxydante FRAP (pouvoir antioxydant réducteur ferrique) de 1 390 mg d'équivalents vitamine C pour 100 ml (3 fois la capacité antioxydante par rapport aux 460 mg d'équivalents vitamine C pour 100 ml mesurés dans le jus d'origine) . L'extrait I peut être reconstitué dans l'eau.
B. Fraction appauvrie en polyphénols (ci-après dénommée « extrait II ») :
Pour la préparation de l'extrait II, du jus de marula entier a été passé à travers 8 couches d'étamine et centrifugé pour éliminer les débris de tissus de fruits. 200 ml de jus clair ont été appliqués sur une colonne de Sepabeads de 20 ml à un débit de 0,4 ml/min. Des fractions de 12 ml ont été recueillies. Les fractions contenant la même concentration en solides solubles totaux (TSS) que le jus clair (12,9 %) ont été combinées. L'activité antioxydante du FRAP mesurée dans cette fraction était de 379 mg d'équivalents vitamine C pour 100 ml, soit environ 83 % de celle mesurée dans le jus clair appliqué sur la colonne.
C. Fraction polyphénolique (ci-après dénommée « extrait III »).
Pour la préparation de l'extrait III, une extraction discontinue a été utilisée pour libérer les polyphénols des billes de colonne décrites ci-dessus. Les billes ont été transférées dans un flacon en verre à fond large et mélangées rigoureusement avec une solution d'éthanol à 85 %. La solution éthanolique a été récupérée et l'étape a été répétée jusqu'à ce que la solution d'extraction soit incolore. Les solutions éthanoliques recueillies ont été réunies, placées dans un ballon rond et évaporées à sec à l'évaporateur rotatif. Le film sec a été dissous dans 1 ml d'eau. Le produit résultant avait une activité FRAP de 5 735 mg d'équivalents vitamine C pour 100 ml, soit environ 12 fois l'activité mesurée dans le jus d'origine.
Pour obtenir une boisson au marula enrichie en polyphénols, 15 ml de fraction de jus appauvrie en polyphénols (extrait II) ont été mélangés avec la fraction polyphénolique isolée (extrait III) ; de l'eau a été ajoutée à un volume final de 25 ml de boisson au marula (comprenant les extraits II et III décrits ici) avec une activité antioxydante FRAP de 446 mg d'équivalents vitamine C pour 100 ml, dont 50 % ont été apportés par la vitamine C et 50 % par les polyphénols, contre ˜75% et 25%, respectivement, dans le jus d'origine.
Les polyphénols totaux ont été dosés par spectrophotométrie par la méthode de Singleton modifiée pour les petits volumes [Singleton V L, et al, Am. J. Emology and Viticulture 16:144-158, 1965]. L'acide gallique (GA) a servi d'étalon. La solution mère de GA a été préparée dans de l'eau à une concentration de 2 mM. Des volumes de 10, 20, 40 et 60 microlitres ont été utilisés pour la courbe standard. Les résultats ont ensuite été exprimés en équivalents GA (GAE). Parfois, le pyrogallol a remplacé le GA comme standard.
3. Méthodes in vitro
FIGUE. 1 montre la concentration totale en polyphénols dans chacun du jus de marula filtré, de l'extrait éthanolique de jus de marula séché (extrait I) et d'un produit obtenu en combinant les extraits II et III décrits ici. La concentration totale était de 7,15, 8,34 et 9,35 mg d'équivalents d'acide gallique (GAE)/ml, respectivement.
FIGUE. 2 présente les chromatogrammes HPLC du jus de marula et des extraits de jus. Chaque extrait de jus a été lavé (1:3) avec du méthanol à 80 % additionné de NaF 2 mM pour extraire les antioxydants. La suspension a été centrifugée et le surnageant a été filtré sur un filtre de 0,45 µm avant injection. Des échantillons de 20 μL ont été analysés à l'aide du système HPLC LaChrom Merck Hitachi, composé d'une pompe L7100, d'un four à colonne L7350 (réglé à 28°C), d'un mélangeur-dégazeur L-7614 et d'un injecteur manuel Rheodyne, couplé à un détecteur à longueur d'onde multiple (Jasco MD- 2010 Plus), interface (Jasco LC-Net II/ADC) et logiciel scientifique (EZChrom Elite Client/Server version 3.1.6 build 3.1.6.2433). Une colonne Purospher®Star RP-18 coiffée (cartouche LichroCART® 250×4 mm, granulométrie 5 μm) avec une colonne de garde Lichrospher®100 RP-18 coiffée (cartouche LichroCART® 4×4 mm, granulométrie 5 μm) ) ont été utilisées.
La fin de la colonne était connectée à un collecteur de fractions (Pharmacia Fine Chemicals, FRAC-100). Les phases mobiles consistaient en (A) acide phosphorique (0,1 %), pH 2,4 et (B) méthanol ; le gradient d'élution a été réglé pour passer de 0 à 100 % de méthanol en 30 minutes. Le débit était de 0,6 mL min−1.
La concentration de vitamine C a été évaluée à partir de la zone sous les pics de chromatogramme correspondants en utilisant de la vitamine C de qualité HPLC (Fluka) pour l'étalonnage. Le méthanol était de qualité HPLC (LiChrosolv Merck); l'eau a été purifiée et filtrée en utilisant des procédures connues ; l'acide phosphorique (Frutarom) et le NaF (Sigma) étaient de qualité analytique. La bibliothèque standard de phénoliques a été construite à l'aide de catéchine, d'acide chlorogénique, caféique et tannique de Sigma, et d'acide 2-hydroxybenzoïque (salicylique), de quercétine-3-β-glucoside et d'acide ellagique de Fluka.
Comme l'indiquent les chromatogrammes HPLC, chaque extrait I, II, III avait une composition unique en ce qui concerne les composés phénoliques [acides phénoliques (PA) et tanins (T)] et la vitamine C. Les trois extraits différaient significativement dans leur composition antioxydante par rapport à l'original. jus.
La capacité de piégeage des radicaux libres des produits à base de jus de marula a également été analysée par le test DPPH [Malterud KM, Farbort T L, Huse ACE, Bredo Sund R. Antioxidant and radical scavenging effects of arthraquinones and anthorones. Pharmacologie. 1993 : 47 : 77-85]. Le DPPH (1,1-diphényl-2-picryl-hydrazyl) est une substance génératrice de radicaux libres largement utilisée pour surveiller les capacités de piégeage des radicaux libres (la capacité d'un composé à donner un électron) de divers antioxydants. Le radical DPPH a une couleur violet foncé en raison de son électron altéré, et le piégeage des radicaux peut être suivi spectrophotométriquement par la perte d'absorbance à 517 nm, lorsque la forme non radicalaire jaune pâle est produite.
Des aliquotes de produit de jus de marula (1,0 μl) ont été mélangées avec 1 mL de 0,1 mmol de DPPH/L dans de l'éthanol, et le changement de densité optique à 517 nm a été surveillé en continu. La capacité des extraits de jus de marula à piéger les radicaux libres a été comparée à la capacité de piégeage des radicaux libres du jus de marula filtré (FIGUES. 3A et 3B).
À une concentration de 1,0 μl/ml, le jus de marula filtré a induit une diminution de 30 % de la densité optique à 517 nm, alors qu'un produit obtenu en combinant les extraits II et III décrits ici (par exemple, le jus de marula enrichi avec des niveaux élevés de polyphénols) induit une diminution de 21 % de la densité optique à 517 nm. La capacité de piégeage des radicaux la plus remarquable a été présentée par l'extrait I, qui a induit une diminution de 54 % de la densité optique à 517 nm (figue. 3A). A des concentrations plus élevées (2,0 μl/ml), le jus de marula filtré et centrifugé induit une diminution de 60% de la densité optique à 517 nm. De même, le produit obtenu en combinant les extraits II et III décrits ici a induit une diminution de 43 % de la densité optique à 517 nm, et la capacité de piégeage des radicaux la plus remarquable a de nouveau été présentée par l'extrait I, qui a induit une diminution de 89 % de la densité optique. densité à 517 nm (FIGUE. 3B).
Les LDL ont été isolées à partir de plasma provenant de volontaires sains normolipidémiques, par ultracentrifugation discontinue en gradient de densité [Aviram, M. (1983) Plasma lipoprotein separation by discontinuous density gradient ultracentrifugation in hyperlipoproteinemic patients. Biochimie. Méd. 30, 111-118]. La LDL a été lavée à d = 1,063 g/ml, dialysée contre 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L Na2EDTA (pH 7,4) à 4°C. Les LDL ont ensuite été stérilisées par filtration (0,45 µM), maintenues sous azote à l'obscurité à 4°C et utilisées dans les 2 semaines. La concentration en protéines LDL a été déterminée avec le réactif Folin Phenol. Avant l'oxydation, la LDL a été dialysée contre une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans EDTA, pH 7,4 et à 4°C.
Le LDL (100 μg de protéine/mL) a été incubé pendant dix minutes à température ambiante avec des concentrations croissantes d'extraits de jus de marula. Ensuite, 5 μmol/L de CuSO4 a été ajouté et les tubes ont été incubés pendant 2 heures à 37°C. A la fin de l'incubation, l'étendue de l'oxydation des LDL a été déterminée en mesurant la quantité générée de substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS) et de peroxydes lipidiques [Aviram M, Vaya J. Marqueurs pour l'oxydation des lipoprotéines de basse densité. Méthodes Enzymol. 2001 ; 335:244-56 ; et Buege J.A., Aust S.D. Microsomal lipid peroxidation. Méthodes Enzymol. 52 : 302-310 (1978)]. Le test du peroxyde lipidique (PD) analyse la formation des peroxydes lipidiques par leur capacité à convertir l'iodure en iode après 18 heures d'incubation à 25°C, mesurée par spectrophotométrie à 365 nm [G. Jürgens. Dosage spectrophotométrique des peroxydes lipidiques dans les lipoprotéines sériques à l'aide d'un réactif disponible dans le commerce. J. Lipid Res. 30 : 627-630, 1986].
L'oxydation des LDL a été mesurée en TBARS (FIGUE. 4A) ou comme formation de peroxydes lipidiques (FIGUE. 4B). L'ajout de concentrations croissantes d'extraits de jus de marula a inhibé l'oxydation des LDL induite par les ions cuivre de manière dose-dépendante. Le CI50 (inhibition de l'oxydation des LDL de 50 %) pour le jus de marula filtré et centrifugé était de 0,80 μl/mL pour le TBARS (FIGUE. 5A) et 0,65 μl/mL pour les peroxydes lipidiques (FIGUE. 5B) formation. Des résultats légèrement inférieurs ont été obtenus pour l'extrait I (0,50 μl/mL pour les TBARS et la formation de peroxydes lipidiques). Au contraire, le CI50 la valeur pour un produit obtenu en combinant les extraits II et III décrits ici était la plus élevée (1,35 et 1,50 pour le TBARS et pour les peroxydes lipidiques, respectivement).
Les macrophages J-774A.1 ont été préincubés avec 10 et 30 μg d'équivalents GAE/ml de produits de jus de marula, puis les cellules ont été analysées pour leur athérogénicité, qui a été évaluée en tant que statut oxydatif des macrophages, absorption des lipoprotéines par les macrophages, efflux de cholestérol médié par les HDL , et la biosynthèse du cholestérol
Le statut oxydatif des macrophages a été déterminé par le test de cytométrie en flux avec du dichlorofluorescine-diacétate (DCFH-DA). Le DCFH-DA est un colorant non polaire qui diffuse dans les cellules. Dans les cellules, il est hydrolysé en le dérivé non fluorescent 2′,7′-dichlorofluorescine (DCFH), qui est polaire et piégé dans les cellules. Sous stress oxydatif, le DCFH est oxydé en DCF, qui est un composé fluorescent. J774 A.1 (2×106) les macrophages ont été incubés avec 2,5×10−5 mol/L DCFH-DA pendant 30 minutes à 37°C. La réaction a été stoppée par des lavages avec du PBS à 4°C. La fluorescence cellulaire a été déterminée avec un appareil de cytométrie en flux (FACS-SCAN, Becton Dickinson, San Jose, Californie, USA ). Les mesures ont été faites à 510 à 540 nm après excitation des cellules à 488 nm avec un laser à argon.
L'incubation des macrophages J-774 A.1 pendant 18 heures à 37°C avec l'extrait I et le jus de marula filtré a réduit le stress oxydatif cellulaire, tel que mesuré par le test DCFH, de 6% et 7%, respectivement. Le produit obtenu en combinant les extraits II et III décrits ici n'a eu aucun effet sur l'état de stress oxydatif des macrophages (FIGUE. 6).
Le LDL (1 mg/mL) a été incubé pendant 18 heures à 37°C avec 5 μmol/L de CuSO fraîchement préparé4. L'oxydation a été arrêtée par réfrigération à 4°C. L'étendue de l'oxydation des LDL a été déterminée par le test TBARS.
Les LDL et Ox-LDL ont été conjugués au fluoroisothiocyanate (FITC) pour des études d'absorption cellulaire. Les lipoprotéines (2,5 mg de protéine/ml) ont été dialysées pendant une nuit à 4°C contre plusieurs changements de tampon borate contenant du borate 0,1 M, du tétraborate de sodium 25 mM, du NaCl 75 mM, pH 8,6. Avant la conjugaison (1 h), le pH du tampon de dialyse a été modifié à 9,4. L'isothiocyanate de fluorescéine (FITC; Sigma-Aldrich) a été dissous dans du diméthylformamide (Merck) et ajouté goutte à goutte à la solution de lipoprotéines pour donner une concentration finale de 0, 2 mg / ml, puis incubé pendant 1 h à température ambiante sous agitation. Les lipoprotéines conjuguées au FITC ont été séparées du FITC non conjugué par chromatographie d'exclusion de taille sur une colonne PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech), en éluant avec un tampon phosphate 10 mM, pH 8,0. Les lipoprotéines marquées au FITC (2 mg/ml) ont été utilisées immédiatement dans les études d'absorption.
Les macrophages J774 A.1 ont été incubés à 37°C pendant 3 heures avec des LDL ou Ox-LDL conjugués au FITC à une concentration finale de 25 μg de protéine/ml. L'absorption de la lipoprotéine a été déterminée par cytométrie en flux. Les mesures de fluorescence cellulaire déterminées par FACS ont été faites à 510 nm à 540 nm après excitation des cellules à 488 nm avec un laser à ions argon. La fluorescence cellulaire a été mesurée en termes d'intensité de fluorescence moyenne (MFI).
L'incubation de macrophages J-774 A.1 pendant 18 heures à 37°C avec des produits de jus de marula (10 ug/ml de GAE) n'a eu aucun effet sur l'absorption de LDL par les macrophages. À une concentration plus élevée de 30 μg/ml de GAE, seul le produit comprenant les extraits II et III décrits ici a réduit l'absorption des macrophages LDL de 9 % (FIGUE. 7). Incubation des macrophages J-774 A.1 pendant 18 heures à 37°C avec l'extrait I, un produit obtenu en combinant les extraits II et III décrits ici et du jus de marula filtré, soit à 10 μg/ml de GAE soit à 30 μg/ml GAE, a réduit l'absorption des Ox-LDL par les macrophages de 12 % et 7 % (extrait I), de 27 % (jus de marula à haute teneur en polyphénols) et de 8 % et 6 % (jus de marula filtré), respectivement (FIGUE. 8).
Les macrophages J774 A.1 ont été incubés avec [3Cholestérol marqué H] (2 μCi/mL) pendant 1 heure à 37°C suivi d'un lavage cellulaire dans du PBS glacé (x3) et d'une nouvelle incubation en l'absence ou en présence de 100 μg de protéine HDL/ml pendant 3 heures à 37° C. Cellulaire et milieu [3Les marqueurs H] ont été quantifiés et l'efflux de cholestérol médié par les HDL a été calculé comme le rapport de [3Marqueur H] dans le milieu/([3H]-marqueur dans le milieu+[3H]-marqueur dans les cellules). L'incubation des macrophages J-774 A.1 pendant 18 heures à 37 °C avec du jus de marula filtré (10 ug/ml de GAE) a augmenté l'efflux de cholestérol des macrophages vers les HDL d'environ 10 %. Cependant, tous les autres produits à base de jus de marula n'ont pas affecté l'efflux de cholestérol médié par les HDL, quelle que soit la concentration utilisée (FIGUE. 9).
Les macrophages J774 A.1 ont été incubés avec [3H] acétate, suivie d'une extraction des lipides cellulaires avec de l'hexane:isopropanol (3:2, v/v) et d'une séparation par chromatographie sur couche mince (TLC) sur des plaques de gel de silice. Les taches de cholestérol non estérifié ont été visualisées par de la vapeur d'iode, raclées dans des flacons à scintillation et comptées pour la radioactivité. Incubation des macrophages J-774 A.1 pendant 18 heures à 37°C avec l'extrait I, produit obtenu en associant les extraits II et III décrits ici et du jus de marula après filtration, le tout à une concentration de 30 μg/ml de GAE, réduit biosynthèse du cholestérol dans les macrophages de 18 %, 7 % et 8 %, respectivement (FIGUE. dix).
Des rats Wistar nouveau-nés ont été obtenus auprès des laboratoires Harlan. Des cultures d'astrocytes primaires de rat ont été préparées à partir des cortex cérébraux de rats Wistar néonataux âgés de 1 à 2 jours. Cette procédure a été approuvée par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux. Les astrocytes ont été étalés dans des plaques à 24 puits à 100 000 ou 80 000 cellules/0,5 ml/puits, respectivement. Toutes les expériences ont été réalisées en présence de 2 % de sérum (FCS). Le milieu d'origine des cellules a été aspiré et du milieu frais a été ajouté aux cellules. Dilutions de H2O2 et les jus de marula dans le milieu de croissance ont été fraîchement préparés à partir de solutions mères juste avant chaque expérience et ont été utilisés immédiatement. Chaque traitement a été réalisé en tétraplicats. La concentration finale de H2O2 était de 200 µM.
Essais de culture de cellules neuronales
Détermination de la viabilité cellulaire - La viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide d'un kit de dosage colorimétrique commercial (fourni par Roche), basé sur la mesure de l'activité de la lactate déshydrogénase (LDH) libérée du cytosol des cellules endommagées dans le surnageant.
Effets protecteurs des extraits - Pour déterminer les conditions optimales (en termes de temps et de dose) pour que les jus exercent leur effet protecteur putatif, les cellules ont été prétraitées avec différentes quantités de chaque produit de jus pendant différentes périodes et les effets protecteurs des produits contre le stress oxydant généré par H2O2 ont été évalués. Les jus (à une dilution de 1:125, 1:500, 1:800 et 1:4000) ont été ajoutés simultanément avec H2O2 ou préincubé pendant deux heures avec les cellules avant son ajout. La toxicité a été contrôlée 20 heures plus tard. FIGUE. 11 montre qu'à toutes les concentrations testées et pour tous les produits de jus, l'ajout concomitant des jus avec H2O2 n'est pas protecteur. Cependant, la préincubation pendant 2 heures avec les cellules avant H2O2 l'ajout a entraîné des effets protecteurs de tous les jus, l'extrait I démontrant l'activité protectrice la plus efficace lorsqu'il est utilisé à de faibles concentrations (1:4000).
Expériences avec des extraits de marula à de faibles concentrations (dilutions 1:1000-1:8000)—Les expériences suivantes ont été réalisées à des concentrations plus faibles des produits (dilutions 1:1000-1:8000), soit ˜55-450 μg/100 ml de vitamine Équivalents C.
Les effets de la période de préincubation (2 heures contre 6 heures) des cellules avec les produits de jus et de la concentration du produit (1:1000-1:8000) ont été testés. FIGUE. 12 montre que tandis que 2 heures de préincubation avec l'extrait I n'ont causé qu'environ 20 % de protection à toutes les concentrations testées, 6 heures de préincubation ont entraîné plus de 80 % de protection.
Dans une autre expérience, l'effet du temps d'incubation et de la concentration a été testé avec 2 dilutions (1:1000 ou 1:4000) de chaque jus, jus de marula filtré et extrait I, pendant 2 ou 6 h avant l'ajout de H2O2 (FIGUE. 13). L'extrait I a été trouvé le plus efficace (70% de protection). Le jus de marula filtré a également montré une activité protectrice significative (40% de protection).
4. Protocole clinique
Dix volontaires sains (tableau 1), non fumeurs et sans troubles métaboliques, avec des taux plasmatiques de cholestérol inférieurs à 200 mg/dl et sous aucun traitement médicamenteux, ont été recrutés pour l'étude. Tous les sujets ont signé un formulaire de consentement avant d'entrer dans l'étude. Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité Rambam Helsinki (n° 2452).
TABLEAU 1
Classification des volontaires de l'étude.
Nom Âge Genre Médicaments Fumeur
SG 21 M Aucun No
SY 21 M Aucun No
vice-président 43 M Aucun No
LE 21 M Aucun No
EY 22 M Aucun No
BTK 27 M Aucun No
DE 57 M Aucun No
RR 24 M Aucun No
MON 40 M Aucun No
GG 37 M Aucun No
Tous les participants ont consommé 200 ml de jus pasteurisé par jour, avec leur repas principal, pendant une période de 3 semaines. Tous les sujets inclus dans l'étude ont poursuivi leur style de vie habituel. La tension artérielle a été mesurée au temps zéro (avant l'entrée dans l'étude), après 3 semaines et à la fin de l'étude (après 4 semaines de sevrage). Des échantillons de sang (25 ml) ont été prélevés pour des analyses au temps zéro (référence - avant l'entrée dans l'étude), après 3 semaines de consommation de jus de marula et 4 semaines après la fin de la consommation de jus (lavage).
Tous les échantillons de sérum sanguin ont été congelés à -80°C jusqu'aux analyses. Des analyses biochimiques dans le sérum ont été effectuées à l'aide de kits de diagnostic disponibles dans le commerce et comprenaient la mesure du glucose, du calcium, de la fonction rénale (BUN, créatinine et les électrolytes sodium et kalium), de la fonction hépatique (CK, AST et bilirubine totale), du cholestérol total, du HDL —cholestérol, LDL-cholestérol et triglycérides totaux. Les niveaux d'acide urique (en tant qu'antioxydant possible) dans le sérum ont été mesurés à l'aide d'un kit disponible dans le commerce.
Analyses de stress oxydatif d'échantillons de sérum
Pouvoir antioxydant réducteur ferrique (FRAP) : Le réactif de travail FRAP a été préparé en mélangeant 25 ml de tampon acétate, 2,5 ml de solution de 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine (TPTZ) et 2,5 ml de FeCL3*6H2Ô solution. Solutions aqueuses de FeSO 1 mM4*7H2O à des concentrations de 5, 10, 20, 30, 40, 50 et 100 mM ont été utilisées pour une courbe d'étalonnage standard. Le réactif FRAP (fraîchement préparé) a été réchauffé à 37°C et un blanc de réactif a été lu à 593 nm par spectrophotométrie. L'échantillon de sérum (30 μl) a été mélangé avec 90 μl d'eau. Ensuite, 900 µl du réactif FRAP ont été ajoutés et mélangés rapidement. L'absorbance a été lue après 0,5 seconde et toutes les 15 secondes pendant 4 minutes. Le changement d'absorbance (A593 nm) entre la densité optique finale et initiale a été calculée pour chaque échantillon et a ensuite été liée à Fe+2 concentration dans la courbe standard (testée en parallèle).
Peroxydation des lipides sériques
Le sérum a été dilué 1:4 (v:v) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) puis incubé en l'absence ou en présence de 100 mmol/L du générateur de radicaux libres chlorhydrate de 2,2′-azobis-2-amidinopropane (AAPH) pendant 2 heures à 37°C. La peroxydation des lipides sériques a été déterminée en mesurant la quantité générée de substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS) et de peroxydes lipidiques en utilisant des méthodes spectrophotométriques. Le test des peroxydes lipidiques (PD) analyse la formation des peroxydes lipidiques par leur capacité à convertir l'iodure en iode après 18 heures d'incubation à 25°C, mesurée par spectrophotométrie à 365 nm.
Comme l'indiquent les résultats de l'étude, la consommation n'a eu aucun effet significatif sur la tension artérielle ; les taux sériques de glucose et de calcium n'ont pas été significativement modifiés après la consommation et les tests de la fonction rénale n'ont pas été significativement affectés par la consommation continue. De même, la consommation a entraîné un taux sanguin d'électrolytes et une fonction hépatique sensiblement inchangés. Cependant, les taux sériques de triglycérides ont diminué de 7 % après la consommation, l'effet persistant après la période de sevrage de 4 semaines (tableau 2).
TABLEAU 2
Effet de la consommation de jus sur les concentrations sériques de triglycérides.
Triglycérides
Sujets 0 3 semaines Lavage
1 79 79 71
2 74 93 92
3 153 163 140
4 48 40 47
5 66 71 82
6 188 121 119
7 147 147 158
8 56 61 87
9 109 85 101
10 196 180 77
Moyenne 112 104 97
Dakota du Sud 55 47 33
La consommation sur une période de 3 semaines a réduit de manière significative (p < 0,02) les concentrations de cholestérol total dans le sérum de 8 % (tableau 3).
TABLEAU 3
Effet de la consommation sur les concentrations de cholestérol sérique
Cholestérol total Cholestérol LDL Cholestérol HDL
Sujets 0 3 semaines Lavage 0 3 semaines Lavage 0 3 semaines Lavage
1 250 245 235 144 119.7 115.91 90.6 109.5 104.89
2 152 141 153 93 67.2 81.95 44.2 55.2 52.65
3 237 182 243 166 112.8 171.71 40.1 36.6 43.29
4 151 143 166 86 59.6 86.12 54.9 75.4 70.48
5 169 148 139 95 72.4 73.22 61.2 61.4 58.95
6 152 142 147 72 69.3 73.82 42 48.5 49.38
7 177 142 179 104 64.1 108.03 43.2 39.3 39.37
8 171 181 210 104 104.9 129.82 56 63.9 62.78
9 256 221 221 175 153.6 149.09 59.5 51.71
10 194 209 215 113 131.1 160.7 41.7 41.9 38.9
Moyenne 191 175.4 190.8 115 95.47 115.037 53.3 59.08 57.24
Dakota du Sud 41.6 38.5 38.4846 34.7 33.19 36.6718 15.4 22.79 19.5595
valeur p 0.02 0.01 0.03
Cette réduction peut être liée à une réduction significative (p<0,01) du taux de LDL-cholestérol, de 17 %. Cependant, ces réductions n'ont pas persisté après la période de sevrage, car les niveaux de cholestérol total, ainsi que ceux de LDL-cholestérol, sont revenus aux niveaux de base après 4 semaines de période de sevrage, au cours desquelles le sujet n'a pas consommé le jus. Le taux sérique de HDL-cholestérol a augmenté significativement (p < 0,03) de 10 % après la consommation du jus et cette diminution a persisté, quoique dans une moindre mesure (de seulement 7 %), après la période de sevrage.
Le tableau 4 montre l'effet sur le stress oxydatif sérique. Des échantillons de sérum ont été soumis à une oxydation induite par l'AAPH. La formation de peroxyde lipidique a été significativement (p < 0,03) diminuée dans les échantillons de sérum prélevés après consommation pendant 3 semaines. Cependant, cet effet n'a pas été maintenu après la période de sevrage. Dans les échantillons de sérum prélevés après consommation, le « pouvoir antioxydant », mesuré par le test FRAP, a augmenté pendant la période de consommation, et a encore augmenté, atteignant une élévation significative de 8 % après la période de sevrage. La réduction du stress oxydatif sérique peut être le résultat de la réduction des concentrations de lipides sériques (moins de substrat disponible pour l'oxydation, ainsi que l'effet des antioxydants puissants du jus de marula).
TABLEAU 4
Effet sur le stress oxydatif sérique
DP FRAP
Sujets 0 3 semaines Lavage 0 3 semaines Lavage
1 798 776 797 837 912 751
2 738 728 733 781 864 897
3 735 715 839 733 661 691
4 798 772 847 615 651 719
5 730 701 758 605 734 613
6 577 567 620 1091 1041 1048
7 615 626 634 767 814 933
8 681 660 659 802 850 948
9 683 711 668 653 663 767
10 696 636 615 917 842 1069
Moyenne 705.10 689.20 717.00 780.10 803.20 843.60
Dakota du Sud 71.13 66.49 89.81 147.42 126.37 156.62
valeur p 0.03 0.03
L'effet de la consommation de jus pasteurisé sur le stress oxydatif sérique est résumé dans FIGUES. 14A-B. Des échantillons de sérum ont été soumis à une oxydation induite par l'AAPH. Formation de peroxyde lipidique (FIGUE. 14A) a été significativement (p<0,03) diminué dans les échantillons de sérum prélevés après consommation du jus sur une période de 3 semaines. Cet effet n'a pas été maintenu après la période de sevrage. La capacité de pouvoir antioxydant, mesurée par le dosage FRAP (FIGUE. 14B), augmenté dans les échantillons de sérum dérivés après consommation de jus de marula pasteurisé, et étonnamment, encore augmenté, atteignant une élévation significative de 8 %, après la période de sevrage.
Réclamations (3)
Masquer la personne à charge L'invention revendiquée est :
1. Procédé de traitement de l'athérosclérose chez un mammifère, comprenant :
l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait, ou d'une composition pharmaceutique comprenant l'extrait, au mammifère, l'extrait étant préparé par un procédé comprenant
séchage du jus de marula en une masse solide ou semi-solide,
mettre en contact la masse solide ou semi-solide avec un solvant organique pour obtenir une suspension, et
éventuellement centrifuger la suspension pour séparer une phase liquide qui comprend l'extrait d'une phase solide.
2. La méthode selon réclamation 1, dans lequel le solvant organique est l'éthanol ou une solution aqueuse comprenant de l'éthanol.
3. La méthode selon revendication 2, dans lequel l'éthanol est présent dans la solution aqueuse en une quantité d'au moins 50 %.

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