Экстракты Sclerocarya birrea (US8445040B2)

Настоящее изобретение в целом относится к водорастворимым экстрактам, полученным из Sclerocarya birrea фрукты и их применение.

Марула ( Sclerocarya birrea, Семейство: Anacardiaceae) — листопадное дерево среднего и крупного размера с прямостоячим стволом и округлой кроной. Растение используется в качестве источника пищи сегодня, как и в древние времена. Плоды марулы съедобны, их обычно едят сырыми или перерабатывают в различные пищевые продукты, такие как желе, а также варят алкогольное пиво, известное вхавенда как мукумби.

Медицинское использование и применение марулы включает использование коры и листьев для лечения заболеваний, связанных с бактериями, и диабета [1,2], а также диареи, как описано в публикации австралийского патента №. 2000/29790 [3].

Международная публикация №. WO 03/092634 [4] описывает применение масла марулы в препаратах для местного применения для ингибирования образования рубцовой ткани на коже.

Было показано, что плоды марулы обладают повышенной общей антиоксидантной способностью [5], обладают способностью ингибировать перекисное окисление фосфолипидов и обладают активностью по удалению супероксидных анион-радикалов [6]. Международная публикация №. WO 06/097806 [7] раскрывает, что различные части растения марула, такие как кора, листья, плоды, корни и семена, содержат гидрофобные антиоксиданты, которые могут быть получены из растения путем мацерации и/или экстракции.

Публикации

Хотя сообщается, что плоды марулы богаты антиоксидантами, до сих пор не сообщалось о приготовлении и использовании экстрактов плодов марулы для лечения заболеваний и расстройств, таких как атеросклероз и нейродегенеративные заболевания.

Неожиданные результаты, раскрытые здесь, показывают, что экстракты, приготовленные из сока марулы, не только стабильны в течение длительных периодов времени, но, что более важно, обладают терапевтическими преимуществами, отличающимися и в некоторых случаях лучшими, чем у необработанного сока марулы. Было показано, что экстракты по изобретению благоприятно влияют на липиды крови, о чем свидетельствует снижение уровня ЛПНП в сыворотке, повышение уровня ЛПВП в сыворотке и ослабление окислительного стресса в сыворотке; экстракты продемонстрировали эффективность при лечении окислительного стресса, атеросклероза, нейродегенерации и связанных с ними расстройств.

Экстракты сока марулы по настоящему изобретению также эффективны для предотвращения нейродегенерации, о чем свидетельствует их защитное действие на нервные клетки, подверженные повреждению свободными радикалами.

Настоящее изобретение также раскрывает применение экстрактов сока марулы в качестве антиоксидантов для использования в самых разнообразных областях, например, использование в пищевых добавках для создания, например, антиатерогенного эффекта у здоровых и нездоровых субъектов (людей и нездоровых людей). человека, животных) и в качестве агентов для лечения или профилактики связанных с нейродегенеративными заболеваниями.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предлагается экстракт, полученный из плодов марулы, за исключением семян, причем указанный экстракт получают способом, включающим подвергание сока, собранного из плодов марулы, экстракции одним или несколькими водными растворами. раствор, органический растворитель и их смесь, т.е. чтобы таким образом получить из сока марулы экстракт, обладающий желаемыми биологическими свойствами.

Сок марулы, полученный из плодов марулы, может быть профильтрован перед экстракцией, чтобы удалить остатки фруктов, такие как остатки семян и другие нерастворимые вещества. Фильтрацию можно проводить с использованием любого известного в данной области техники способа фильтрации напитков, такого как, но не ограничиваясь этим, фильтрация на основе диатомовой земли (DE) и мембранная фильтрация.

В некоторых вариантах осуществления сок марулы, полученный из плодов марулы, пастеризуют перед экстракцией, чтобы замедлить рост микробов в соке за счет уменьшения количества жизнеспособных патогенов в нем. Обычно пастеризацию проводят, подвергая сок воздействию температуры ниже кипения. В некоторых вариантах осуществления пастеризация достигается одним или несколькими другими способами пастеризации, известными в данной области техники, например, контролируемыми национальными агентствами по безопасности пищевых продуктов (такими как Министерство сельского хозяйства США в США и Агентство по пищевым стандартам в Соединенном Королевстве). Некоторые неограничивающие примеры включают высокотемпературную/коротковременную пастеризацию (HTST), пастеризацию с увеличенным сроком хранения (ESL), сверхвысокотемпературную (UHT или ультратермическую обработку) пастеризацию и периодическую пастеризацию или пастеризацию в ванне.

Термин «экстракт», используемый в данном документе, относится к водорастворимому продукту, полученному из любой части плода марулы или любой части, полученной из него, за исключением семян, но включая один или несколько мезокарпий, эндокарпий, кожуру (толстую внешнюю кожуру), и/или кожура (экзокарпий), используя метод, выбранный из экспрессии, абсорбции, мацерации, лиофилизации, дистилляции и любой комбинации двух или более из этих процессов.

Экстрагированные вещества, отдельно или в комбинации, могут быть преобразованы в любой желаемый состав, включая водный раствор, твердое вещество, такое как сухой порошок, гранулы или пилюли, концентрат, например, полужидкость, имеющую сиропообразную консистенцию, которая может можно получить путем выпаривания всего или почти всего жидкого содержимого экстракта или любой другой формы. Как правило, методы извлечения материала могут различаться. с соответствующими изменениями в зависимости от возраста плодов марулы, подтипа, сезона сбора урожая, региона произрастания, экстрагируемых веществ, их стабильности и других факторов, известных специалисту в данной области.

В некоторых вариантах осуществления экстракт по изобретению получают контактированием сока марулы с водным раствором для извлечения из него одного или нескольких ингредиентов или их комбинации. «Водный раствор» может быть в самых общих чертах водой (в некоторых вариантах осуществления вода с различной концентрацией природных минералов) или дистиллированной или иным образом очищенной (дистиллированной или очищенной любым другим способом) водой, водным солевым раствором, содержащим одну или несколько солей или смесь воды с одним или несколькими смешиваемыми с водой полярными растворителями, например, C ₁ -C ₄ спирты и кетоны.

В некоторых вариантах осуществления водный растворитель представляет собой смесь воды и по меньшей мере одного спирта. В некоторых дополнительных вариантах осуществления водный растворитель представляет собой смесь воды и этанола, где соотношение вода:этанол составляет одно из значений 1:1, 1:2. . . 1:5 . . . 1:10 . . . 1:100 . . . 1:1000. . . д. соответственно или 2:1, 3:1. . . 5:1 . . . 10:1 . . . 100:1. . . 1000:1 и т. д. соответственно. Любое другое промежуточное соотношение также включено.

В альтернативном варианте для экстракции можно использовать органический растворитель отдельно или в сочетании с другим таким растворителем. В некоторых вариантах осуществления процесс экстракции представляет собой многостадийный процесс, при котором плоды марулы (сок) контактируют сначала с одним растворителем, а затем с другим растворителем, чтобы максимизировать выход или обогатить экстракт одним или несколькими желаемыми компонентами.

Обычно органический растворитель представляет собой по меньшей мере один спирт, такой как метанол, этанол и изопропиловый спирт, или кетон, такой как ацетон. Когда используют этанол, его можно использовать в виде водного этанольного раствора, например, с концентрацией этанола примерно от 40 до 60%. Аналогичные растворы можно также использовать с другими смешиваемыми с водой органическими растворителями. Экстракт, полученный после спиртового экстракта, обозначается здесь как экстракт I.

В контексте настоящего изобретения следует понимать, что экстракцию этанолом или любую другую экстракцию, раскрытую здесь, можно проводить при любой удобной температуре. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что более эффективная экстракция будет происходить, если сок взболтать, например, путем перемешивания или встряхивания, и/или если смесь нагреть до температуры выше комнатной (выше 25-27°С). .). Можно также использовать более низкие температуры экстракции, например ниже комнатной температуры. В некоторых вариантах осуществления процесс экстрагирования проводят при комнатной температуре или при температуре от 25 до 30°C.

Также следует понимать в контексте настоящего изобретения, что экстракцию можно проводить в течение любого удобного периода времени.

Специалисту в данной области будет также понятно, что процесс получения экстракта по изобретению может включать мацерацию плодов марулы для получения более мелких кусочков целых плодов, из которых можно получить экстракты одним или несколькими другими способами экстракции, такими как дистилляция. В качестве альтернативы экстракт может быть получен путем отжима, а именно путем отжима сока из фруктов.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления перед контактированием сока с одним или несколькими растворителями, как описано, фрукт, т. е. целые фрукты, за исключением семян или любой их части, могут быть предварительно обработаны путем мацерации, отжима или любого другого процесса.

Сок, полученный из плодов марулы, может храниться до экстрагирования или предварительной обработки, например сушки, в течение продолжительных периодов времени. Хранение может осуществляться при любой температуре и условиях, при которых сохраняется свежесть сока и предотвращается или сводится к минимуму его разложение. Такие температуры могут быть выше или ниже комнатной температуры. В некоторых вариантах осуществления сок можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель или в морозильной камере в течение нескольких лет. При использовании замораживания сока процесс может дополнительно включать стадию размораживания сока перед экстракцией или переработкой.

Сушка сока может быть достигнута путем нагревания жидкого сока в вакууме или при атмосферном давлении при заданной температуре, которая может быть комнатной или выше температуры окружающей среды, за один раз или в меньших количествах, чтобы контролировать содержание влаги в соке. экстракт. В раскрытом здесь неограничивающем примере сушка достигается путем выливания сока на поверхность, такую ​​как поднос, в некоторых случаях покрытую фольгой (например, алюминиевой фольгой) для равномерного нагрева сока и получения по существу однородного слоя. высушенного экстракта марулы.

Влажный концентрат (сироп), полученный при сушке, имеет цвет от желтоватого до темно-коричневого в зависимости от концентрации и типа экстракта. Высушенный материал легко измельчается и имеет цвет от светло-золотистого до темно-коричневого в зависимости от типа экстракта. Высушенное вещество растворимо в воде.

Полученный после этого экстракт марулы содержит различные количества летучих веществ, причем количества зависят от продолжительности периода сушки и используемой температуры. Не желая быть связанными какой-либо теорией, после удаления летучих компонентов концентрат, а именно, в некоторых вариантах осуществления, порошкообразный экстракт, содержит по сравнению с цельным фруктовым соком более высокую концентрацию активных компонентов, присутствие и сочетание которых обеспечивает высокую активность, которая не наблюдается в целом плоде и демонстрируется здесь.

Таким образом, экстракт получают способом, включающим контактирование сока марулы с водным растворителем, как определено, для получения суспензии, из которой может быть выделен жидкий экстракт.

В некоторых вариантах осуществления способ включает:

В некоторых вариантах осуществления перед экстракцией собранный сок сушат или предварительно обрабатывают, как описано.

В дополнительных вариантах осуществления разделение жидкого экстракта на стадии (iii) может осуществляться путем центрифугирования суспензии, полученной на стадии (ii), для отделения жидкого экстракта в виде надосадочной жидкости от твердой массы.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления способ включает:

В дополнительных вариантах осуществления способ включает:

В некоторых других вариантах осуществления способ включает:

Следует отметить, что разделение жидкого экстракта можно повторять более одного раза со вторым количеством того же или другого растворителя, а надосадочные жидкости, полученные на каждой стадии, можно объединять и дополнительно обрабатывать для выделения, концентрирования или дальнейшей обработки. извлекать. Таким образом, два или более супернатантов могут быть объединены, а растворитель и/или часть воды могут быть удалены, например, с использованием любого метода удаления растворителя.

Когда исходный фруктовый материал включает твердое вещество или в случаях, когда плоды марулы были переработаны в высушенный или полувысушенный порошок или гранулированную форму, экстракт может быть разделен, по меньшей мере, на твердую фазу и водную фазу, причем каждая фаза имеет биологическая активность, раскрытая здесь.

Экстракт по изобретению, полученный с использованием одного или нескольких процессов, описанных в настоящем документе, может характеризоваться одним или несколькими из следующих признаков:

Таким образом, изобретение также обеспечивает экстракт марулы, характеризующийся антиоксидантной способностью FRAP минимум 1000 и 1500 мг эквивалентов витамина С на 100 мл. Это сопоставимо с FRAP, измеренным для необработанного сока марулы с содержанием витамина С от 260 до 600 мг на 100 мл. другими словами, способность экстракта по изобретению к FRAP в 2-3 раза превышает активность, наблюдаемую в исходном необработанном соке.

В некоторых вариантах осуществления экстракт, имеющий указанную выше емкость FRAP, представляет собой экстракт I.

Настоящее изобретение также относится к экстракту, содержащему обедненную полифенольную фракцию, указанный экстракт обозначен здесь как экстракт II. Полифенольная фракция, обозначенная здесь как экстракт III, может быть отделена от сока марулы, например, хроматографией сока марулы с получением экстракта II (обедненного) и экстракта III (выделенной фенольной фракции). В некоторых вариантах осуществления истощение полифенольной фракции достигается процессом, включающим фильтрацию сока марулы, например, путем пропускания сока через один или несколько слоев марли (разных сортов, например, от ажурной до сверхтонкой ткани, используемой в соответствии с качество и количество сока), возможно, центрифугирование отфильтрованного сока для удаления фруктовых остатков, применение прозрачного сока для хроматографии, например, колоночная хроматография с использованием колонок, заполненных ионообменными и адсорбирующими смолами Sepabeads, или C ₁₈ -связанный диоксид кремния или смолы для гидрофобное взаимодействие и хроматография с обращенной фазой, сбор фракций и объединение фракций, имеющих одинаковое общее количество растворимых твердых веществ (TSS).

В некоторых вариантах осуществления фракция полифенолов может быть собрана из среды, используемой для хроматографии, например из гранул колонки, путем смешивания среды, например гранул, со спиртовым раствором (этанол, метанол и т.д.). Затем спиртовые фракции можно объединить и выпарить досуха.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления для получения экстракта с повышенным соотношением полифенолов и витамина С полифенольную фракцию (т.е. экстракт III) можно отделить от сока и затем добавить к обедненной полифенолами фракции (т.е. экстракту II) . В некоторых других вариантах осуществления экстракт II объединен с экстрактом I.

В некоторых вариантах осуществления экстракт II характеризуется антиоксидантной способностью FRAP, составляющей по меньшей мере от 250 до 500 мг эквивалентов витамина С на 100 мл.

Используемый здесь термин «полифенолы» относится к группе веществ, характеризующихся наличием более чем одного фенольного звена или строительного блока на молекулу. Полифенолы обычно делятся на гидролизуемые дубильные вещества (сложные эфиры галловой кислоты с глюкозой и другими сахарами) и фенилпропаноиды, такие как лигнины, флавоноиды и конденсированные дубильные вещества. В некоторых вариантах осуществления полифенолы, полученные из сока макулы, включают гидролизуемые дубильные вещества, катехины и гидроксикоричные кислоты и/или их производные.

В другом одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает применение по меньшей мере одного экстракта по настоящему изобретению для приготовления композиции.

В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

В дополнительных вариантах осуществления экстракт представляет собой активный ингредиент, присутствующий в композиции вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

Выбор носителя будет частично определяться конкретным экстрактом, а также конкретным методом, используемым для введения содержащей его композиции. Соответственно, существует большое разнообразие подходящих составов фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Следующие составы для перорального, аэрозольного, парентерального, подкожного, внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшинного, ректального и вагинального введения являются просто иллюстративными и никоим образом не ограничивают.

Составы, подходящие для перорального введения, могут состоять из (а) жидких растворов, таких как эффективное количество экстракта, растворенного в разбавителях, таких как вода, физиологический раствор или апельсиновый сок; (b) капсулы, саше, таблетки, пастилки и пастилки, каждая из которых содержит заданное количество экстракта в виде твердых веществ или гранул; (в) порошки; (d) суспензии в соответствующей жидкости; и (e) подходящие эмульсии. Жидкие составы могут включать разбавители, такие как вода и спирты, например, этанол, бензиловый спирт и полиэтиленовые спирты, с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, суспендирующего агента или эмульгирующего агента. Капсулы могут быть обычными желатиновыми с твердой или мягкой оболочкой, содержащими, например, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества и инертные наполнители, такие как лактоза, сахароза, фосфат кальция и кукурузный крахмал. Таблетированные формы могут включать лактозу, сахарозу, маннит, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту, микрокристаллическую целлюлозу, гуммиарабик, желатин, гуаровую камедь, коллоидный диоксид кремния, кроскармеллозу натрия, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка. , стеариновая кислота и другие эксципиенты, красители, разбавители, буферные агенты, разрыхлители, увлажняющие агенты, консерванты, ароматизаторы и фармакологически совместимые носители. Формы для рассасывания могут содержать активный ингредиент в ароматизаторе, обычно сахарозу и аравийскую камедь или трагакант, а также пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь, эмульсии, гели и т.п., содержащие , в дополнение к экстракту, такие носители, которые известны в данной области техники.

Экстракты или композиции по настоящему изобретению, например фармацевтическая композиция, сами по себе или в комбинации с другими подходящими компонентами, могут быть превращены в аэрозольные составы для введения посредством ингаляции. Эти аэрозольные составы могут быть помещены в приемлемые газы-вытеснители под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Они также могут быть приготовлены в виде фармацевтических препаратов для препаратов без давления, например, в небулайзере или распылителе.

Препараты, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные, изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, придающие препарату изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные растворы. суспензии, которые включают суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Соединение можно вводить в физиологически приемлемом разбавителе в фармацевтическом носителе, таком как стерильная жидкость или смесь жидкостей, включая воду, физиологический раствор, водную декстрозу и родственные растворы сахаров, спирт, такой как этанол, изопропанол или гексадециловый спирт, гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, кетали глицерина, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, простые эфиры, такие как полиэтиленгликоль 400, масло, жирная кислота, жирный сложный эфир кислоты или глицерид, или ацетилированный глицерид жирной кислоты с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, такого как мыло или детергент, суспендирующего агента, такого как пектин, карбомеры, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза, или эмульгаторов и другие фармацевтические адъюванты.

Масла, которые можно использовать в препаратах для парентерального введения, включают нефтяные, животные, растительные или синтетические масла. Конкретные примеры масел включают арахисовое, соевое, кунжутное, хлопковое, кукурузное, оливковое, вазелиновое и минеральное. Подходящие жирные кислоты для использования в парентеральных препаратах включают олеиновую кислоту, стеариновую кислоту и изостеариновую кислоту. Этилолеат и изопропилмиристат являются примерами подходящих сложных эфиров жирных кислот. Подходящие мыла для использования в парентеральных препаратах включают соли жирных щелочных металлов, аммония и триэтаноламина, а подходящие детергенты включают (а) катионные детергенты, такие как, например, галогениды диметилдиалкиламмония и галогениды алкилпиридиния, (b) анионные детергенты, такие как , например, алкил-, арил- и олефинсульфонаты, алкил-, олефиновые, эфирные и моноглицеридсульфаты и сульфосукцинаты, (c) неионогенные детергенты, такие как, например, оксиды жирных аминов, алканоламиды жирных кислот и сополимеры полиоксиэтиленполипропилена, (d) амфотерные детергенты, такие как, например, алкил-β-аминоприопионаты и соли четвертичного аммония 2-алкилимидазолина и (3) их смеси.

Парентеральные составы обычно содержат от около 0,5 до около 25 мас.% экстракта в растворе. В таких препаратах можно использовать подходящие консерванты и буферы. Чтобы свести к минимуму или устранить раздражение в месте инъекции, такие композиции могут содержать одно или несколько неионогенных поверхностно-активных веществ, имеющих гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) от примерно 12 до примерно 17. Количество поверхностно-активного вещества в таких композициях составляет от примерно 5 примерно до 15% по массе. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сложные эфиры полиэтиленсорбитана и жирной кислоты, такие как моноолеат сорбитана, и высокомолекулярные аддукты этиленоксида с гидрофобным основанием, образованные конденсацией пропиленоксида с пропиленгликолем. Парентеральные составы могут быть представлены в однодозовых или многодозовых герметичных контейнерах, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в лиофилизированном (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды. , для инъекций, непосредственно перед применением. Растворы для инъекций и суспензии для экспроприации можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных выше.

Экстракты и композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препаратов для инъекций. Требования к эффективным фармацевтическим носителям для инъекционных композиций хорошо известны специалистам в данной области. Видеть Фармацевтика и аптечная практика, JB Lippincott Co., Филадельфия, Пенсильвания, Banker and Chalmers, ред., стр. 238-250 (1982), и Справочник ASHP по инъекционным наркотикам, Туассель, 4 ^-й изд., страницы 622-630 (1986).

Кроме того, экстракты по настоящему изобретению могут быть превращены в суппозитории путем смешивания с различными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Препараты, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие носители, которые, как известно в данной области техники, являются подходящими.

Как указано выше, экстракты и композиции по изобретению могут быть изготовлены, представлены и/или сохранены в любой форме, а именно в форме жидкости, концентрата, сухого порошка, раствора, эмульсии или маточного раствора или биржевой концентрат.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предназначена для лечения или профилактики по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с повреждением в результате окислительного стресса.

Окислительный стресс является результатом дисбаланса прооксидантного/антиоксидантного гомеостаза, что приводит к образованию токсичных активных форм кислорода. Свободные радикалы образуются, когда кислород взаимодействует с определенными молекулами и запускает цепную реакцию повреждения важных клеточных компонентов. Таким образом, воспаление и окислительные процессы взаимосвязаны. Кроме того, окислительный стресс может вызывать цитотоксичность клеток крови, стимулировать высвобождение воспалительных цитокинов и индуцировать выработку факторов роста. Окислительный стресс играет решающую роль в формировании бляшек и, наряду с присущим сосудистым воспалением, может быть сильным предиктором атеросклероза.

Таким образом, как используется в данном документе, «повреждение от окислительного стресса» относится к повреждению клеток, тканей и/или органов животного, включая человека, которое вызвано дисбалансом между производством реактивного кислорода и способностью биологической системы легко реагировать. детоксифицируют реактивные промежуточные продукты или легко восстанавливают полученные повреждения. Чаще всего нарушения в этом нормальном окислительно-восстановительном состоянии могут вызывать токсические эффекты за счет образования перекисей и свободных радикалов, которые повреждают все или некоторые компоненты клетки, включая белки, липиды и ДНК.

В некоторых вариантах осуществления повреждение окислительного стресса связано с нарушением или заболеванием, выбранным из атеросклероза, болезни Паркинсона, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, нейродегенеративных заболеваний или расстройств, заболеваний глаз, синдрома хронической усталости и других.

Атеросклероз, ведущая причина заболеваемости и смертности людей, ведущих западный образ жизни, развивается в результате действия различных факторов риска. Гиперхолестеринемия является основным фактором риска атеросклероза, а снижение концентрации холестерина в плазме с помощью медикаментозной терапии снижает частоту сердечно-сосудистых заболеваний. Атеросклеротическое поражение характеризуется ускоренным окислительным стрессом и образованием активных форм кислорода (АФК), которые атакуют липиды в липопротеинах, а также в артериальных макрофагах. Окислительная модификация липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) играет ключевую роль в патогенезе атеросклероза. Окисленный ЛПНП (Ох-ЛПНП) вносит основной вклад в развитие атеросклеротических поражений, поскольку стимулирует накопление макрофагами холестерина и образование пенистых клеток. В отличие от атерогенности ЛПНП, уровни липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в сыворотке обратно пропорциональны риску атеросклероза. ЛПВП оказывает ингибирующее действие на окисление ЛПНП, и этот эффект может быть связан с ассоциированным с ним ферментом параоксоназой 1 (PON1).

Атеросклероз также представляет собой процесс или расстройство, связанное с накоплением бляшек на внутренней стороне артерий, в том числе в сердце, головном мозге, руках, ногах и тазу. Таким образом, этот термин может также относиться к прогрессирующему накоплению гладкомышечных клеток, иммунных клеток (например, лимфоцитов, макрофагов или моноцитов), липидных продуктов (например, липопротеинов или холестерина), клеточных отходов, кальция или других веществ в внутренней оболочки артерии, что приводит к сужению или закупорке кровеносного сосуда и развитию заболеваний, связанных с атеросклерозом.

Поскольку атеросклероз проявляется в крупных и средних артериях, лечение или профилактика часто влияют на развитие состояния хронического воспаления в артериях.

Таким образом, экстракт по изобретению подходит также для лечения и профилактики состояний, включая атеросклероз коронарных артерий, вызывающий заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, тромбоз коронарных артерий и стенокардию; атеросклероз артерий, питающих центральную нервную систему, вызывающий инсульты и транзиторную ишемию головного мозга; атеросклероз периферического кровообращения, вызывающий перемежающуюся хромоту и гангрену; атеросклероз артерии внутреннего кровообращения, вызывающий мезентериальную ишемию; и стеноз почечной артерии.

Таким образом, композиция по изобретению также пригодна для лечения или профилактики по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с одним или несколькими из следующих факторов: повышенная концентрация триглицеридов липидов в сыворотке крови, концентрация холестерина в сыворотке крови и концентрация общего холестерина холестерина ЛПНП в сыворотке крови и снижение уровня ЛПВП. концентрации холестерина.

В данном контексте такое заболевание или расстройство, связанное с повышенными концентрациями триглицеридов липидов в сыворотке, концентрациями холестерина в сыворотке и концентрациями общего холестерина и холестерина ЛПНП в сыворотке, а также сниженными концентрациями холестерина ЛПВП, включает аномально высокие уровни холестерина (гиперхолестеринемия) и/или высокие уровни ЛПНП. или триглицеридов и/или более низкие концентрации функциональных ЛПВП, такие как ишемическая болезнь сердца или другие формы сердечно-сосудистых заболеваний, а также заболевания или расстройства, которые включают развитие атером в артериях (т.е. атеросклероз), такие как гипохолестеринемия, заболевания периферических сосудов, диабет и высокое кровяное давление.

Окислительный стресс также связан с гибелью нейронов, которая связана с различными нейродегенеративными состояниями. Нейродегенеративные заболевания — это состояния, при которых происходит потеря клеток головного и спинного мозга. Обычно нейродегенерация начинается задолго до того, как у пациента появляются какие-либо симптомы. Поскольку клетки головного мозга постоянно подвергаются воздействию активных форм кислорода, образующихся в результате окислительного метаболизма, окислительный стресс также является одним из предрасполагающих факторов неврологических расстройств у взрослых и участвует в патогенезе некоторых из этих расстройств, таких как болезнь Паркинсона.

Экстракт или композиция по изобретению также используется для лечения или профилактики по меньшей мере одного связанного с нейродегенеративным заболеванием или расстройством.

«Нейродегенеративные заболевания или расстройства» в контексте настоящего изобретения относятся к одному или нескольким состояниям, при которых клетки головного и спинного мозга утрачиваются в результате разрушения нейронов или их миелиновой оболочки, что со временем приводит к дисфункции. и вытекающие из этого инвалидности. Таким образом, нейродегенеративные заболевания или расстройства связаны с состояниями, вызывающими проблемы с движениями, такими как атаксия, а также с состояниями, влияющими на память и связанными с деменцией. Некоторые неограничивающие примеры нейродегенеративных заболеваний или нарушений включают алкоголизм, болезнь Александра, болезнь Альпера, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (болезнь Лу Герига), атаксию-телеангиэктазию, болезнь Баттена (также известную как болезнь Шпильмейера-Фогта-Шегрена-Баттена), губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭКРС), болезнь Канавана, церебральный паралич, синдром Коккейна, корково-базальная дегенерация, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, лобно-височная долевая дегенерация, болезнь Хантингтона, ВИЧ-ассоциированная деменция, болезнь Кеннеди, болезнь Краббе, деменция с тельцами Леви, нейроборрелиоз, мачадо- Болезнь Джозефа (спиноцеребеллярная атаксия 3 типа), множественная системная атрофия, рассеянный склероз, нарколепсия, болезнь Нимана-Пика, болезнь Паркинсона, болезнь Пелизеуса-Мерцбахера, болезнь Пика, первичный латеральный склероз, прионные заболевания, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Рефсума, болезнь Сандхоффса, болезнь Чайлдера, подострая комбинированная дегенерация спинного мозга на фоне перницио анемия, спиноцеребеллярная атаксия, спинальная мышечная атрофия, болезнь Стила-Ричардсона-Ольшевского и спинная сухотка.

В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с повреждением окислительного стресса у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества экстракта по настоящему изобретению. или фармацевтическая композиция, содержащая их.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с одним или несколькими из следующих факторов: повышенные концентрации триглицеридов липидов в сыворотке, концентрации холестерина в сыворотке, концентрации общего холестерина и холестерина ЛПНП в сыворотке и сниженные концентрации ЛПВП. концентрации холестерина у млекопитающего, включая введение указанному млекопитающему эффективного количества экстракта по изобретению или содержащей его фармацевтической композиции.

В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики по меньшей мере одного ассоциированного с нейродегенеративным заболеванием или расстройству у млекопитающего, включающему введение указанному млекопитающему эффективного количества экстракта по изобретению или фармацевтической композиции, содержащей из этого.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к антиоксиданту, содержащему экстракт по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к агенту, снижающему уровень холестерина, содержащему экстракт по изобретению.

В рамках настоящего изобретения термин «лечение и/или профилактика» относится к введению терапевтического количества композиции по настоящему изобретению, которая эффективна для облегчения нежелательных симптомов, связанных с заболеванием, для предотвращения проявления таких симптомы до их появления, замедлить прогрессирование заболевания, замедлить ухудшение симптомов, ускорить наступление периода ремиссии, замедлить необратимые повреждения, вызванные прогрессирующей хронической стадией заболевания, отсрочить начало указанного прогрессирующую стадию, чтобы уменьшить тяжесть или вылечить заболевание, улучшить выживаемость или более быстрое выздоровление, или предотвратить возникновение формы заболевания или комбинации двух или более из вышеперечисленных.

Экстракт или композицию по изобретению можно вводить любым способом, известным специалисту в данной области. Как правило, введение экстракта или фармацевтической композиции, содержащей его, представляет собой эффективное количество экстракта(ов), содержащихся в композиции. «Эффективное количество» для целей настоящего документа определяется такими соображениями, которые могут быть известны в данной области техники. Количество должно быть эффективным для достижения желаемого терапевтического эффекта, как описано выше, в зависимости, среди прочего, от типа и тяжести заболевания, подлежащего лечению, и схемы лечения. Эффективное количество обычно определяют в надлежащим образом спланированных клинических испытаниях (например, исследованиях диапазона доз), и специалист в данной области знает, как должным образом проводить такие испытания, чтобы определить эффективное количество. Как известно, эффективное количество зависит от множества факторов, включая сродство лиганда к рецептору, профиль его распределения в организме, множество фармакологических параметров, таких как период полувыведения в организме, нежелательные побочные эффекты, если любой, по таким факторам, как возраст и пол и т.д.

Экстракт по изобретению можно также использовать для приготовления композиции для применения в различных нефармацевтических применениях. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой антиоксидантную композицию для использования в качестве консерванта для самых разнообразных применений в пищевой промышленности, косметической промышленности, терапевтических средствах и т. д., а также для ингибирования индуцированного ионами меди окисления ЛПНП in vitro или в естественных условиях.

Экстракт, раскрытый в данном документе, может дополнительно использоваться в качестве пищевой добавки или в качестве активного компонента такой добавки. В некоторых вариантах осуществления добавка подходит для потребления как людьми, так и животными, отличными от человека, для улучшения самочувствия, а также для лечения и профилактики состояний и расстройств, связанных с окислительным повреждением.

В контексте настоящего изобретения пищевая добавка, в зависимости от ее природы и физической формы, например липофильной или гидрофильной по своей природе, может дополнительно содержать один или несколько эмульгаторов, стабилизаторов, антиоксидантов и других добавок. Используют эмульгаторы, совместимые с пищевыми продуктами, такие как фосфолипиды, например лецитин, моно- или тристеарат полиоксиэтиленсорбитана, монолаурат, монопальмитат, моно- или триолеат, моно- или диглицерид. Эти эмульгаторы, стабилизаторы, антиоксиданты и добавки могут быть добавлены к экстракту по изобретению в соответствии с конечным применением указанного экстракта.

Описанная здесь пищевая добавка может также содержать синтетические или натуральные биологически активные вещества, такие как аминокислоты, жирные кислоты, витамины, минералы, полифенолы и т. д., которые можно добавлять к указанной композиции либо путем сухого, либо путем влажного смешивания перед пастеризацией и/или сушкой.

В некоторых вариантах осуществления пищевая добавка представляет собой полноценную питательную смесь, молочный продукт, охлажденный напиток или напиток длительного хранения, минеральную или очищенную воду, жидкий напиток, суп, пищевую добавку, заменитель пищи, питательный батончик, кондитерские изделия, молочный или кисломолочный продукт, йогурт, сухой молочный продукт, продукт энтерального питания, детская смесь, продукт детского питания, зерновой продукт или кисломолочный продукт на основе крупы, мороженое, шоколад, кофе, кулинарные изделия, такие как майонез, томатное пюре или заправки для салатов, или корм для домашних животных. В соответствии с этими вариантами осуществления экстракт по изобретению может быть диспергирован в пищевых продуктах или напитках таким образом, чтобы обеспечить ежедневное потребление биоактивных питательных веществ, которое зависит, главным образом, от типа пищи, в которой диспергирован экстракт, желаемого эффекта и ткани-мишени. . Количество пищевой добавки, потребляемой индивидуумом для получения полезного эффекта, также будет зависеть от одного или нескольких различных факторов, таких как тип добавки и/или пищи, а также возраст и вес потребителя.

Пищевая добавка для перорального введения может быть в капсулах, желатиновых капсулах, мягких капсулах, таблетках, таблетках с сахарным покрытием, пилюлях, пастах или пастилках, жевательных резинках или растворах или эмульсиях для питья, сиропе или геле с дозой примерно от 0,1 до 100% экстракта по изобретению, который затем можно принимать непосредственно с водой или любым другим известным способом. Эта добавка может также включать подсластитель, стабилизатор, антиоксидант, добавку, ароматизатор или краситель.

Понятно, что некоторые признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть представлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предоставлены по отдельности или в любой подходящей комбинации или как подходящие в любом другом описанном варианте осуществления изобретения. Некоторые признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны считаться существенными признаками этих вариантов осуществления, за исключением случаев, когда вариант осуществления не работает без этих элементов.

Используемый здесь способ, экстракт или композиции по изобретению могут включать дополнительные стадии, ингредиенты или части, только если дополнительные стадии, ингредиенты или части не изменяют основные и новые характеристики заявленного процесса, экстракта и композиций. Используемые здесь формы единственного числа «a», «an» и «the» включают ссылки во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, описанные выше и заявленные в разделе формулы изобретения ниже, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.

1. Сушка сока марулы

Плоды марулы были собраны с земли в течение 10 дней после того, как плоды упали с деревьев, а затем отжаты гидравлическим прессом под давлением 35 бар (оливковый пресс Enorossi, модель 250). Сок собирали и хранили в замороженном виде при -20°С в течение различных сроков до 3 лет. Непосредственно перед сушкой сок размораживали и распределяли по противням из алюминиевой фольги, формируя равномерный слой толщиной 0,7 см. Лотки, содержащие сок, помещали в вакуумную печь (Tuttnauer, сушильный стерилизатор, модель 11-900), установленную на 57°С и -760 мм ртутного столба, на 3 дня. После высушивания, содержащего примерно 1% влаги, твердое вещество измельчали ​​с получением порошка, хорошо растворимого в воде. Порошок выдерживали в эксикаторе при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

2. Препараты экстракта марулы

A. Этанольный экстракт (обозначаемый здесь как «Экстракт I»)

Для приготовления экстракта I 15 г высушенного сока марулы измельчали ​​в порошок, суспендировали в 50 мл 50%-ного этанола и помещали на шейкер на 20 мин. Суспензию центрифугировали и супернатант переносили в круглую колбу. Стадию повторяли с дополнительными 25 мл 50% этанола. Два супернатанта объединяли, этанол и часть воды удаляли с помощью роторного испарителя. Конечный водный раствор объемом 30 мл имел антиоксидантную способность FRAP (железо, уменьшающее антиоксидантную способность), составляющую 1390 мг эквивалентов витамина С на 100 мл (в 3 раза больше антиоксидантной способности по сравнению с эквивалентами витамина С 460 мг на 100 мл, измеренными в исходном соке). . Экстракт I может быть восстановлен в воде.

B. Фракция, обедненная полифенолами (обозначаемая здесь как «Экстракт II»):

Для приготовления экстракта II цельный сок марулы пропускали через 8 слоев марли и центрифугировали для удаления остатков тканей плода. 200 мл прозрачного сока наносили на колонку Sepabeads объемом 20 мл при скорости потока 0,4 мл/мин. Собирали фракции по 12 мл. Фракции, содержащие такую ​​же общую концентрацию растворимых сухих веществ (TSS), как и чистый сок (12,9%), объединяли. Антиоксидантная активность FRAP, измеренная в этой фракции, составила 379 мг эквивалента витамина С на 100 мл, что составляет примерно 83% от активности, измеренной в прозрачном соке, нанесенном на колонку.

C. Полифенольная фракция (обозначаемая здесь как «Экстракт III»).

Для приготовления экстракта III использовали периодическую экстракцию для высвобождения полифенолов из гранул колонки, описанных выше. Гранулы переносили в широкодонную стеклянную колбу и тщательно перемешивали с 85% раствором этанола. Этанольный раствор извлекали, и стадию повторяли до тех пор, пока экстракционный раствор не становился бесцветным. Собранные спиртовые растворы объединяли, помещали в круглодонную колбу и упаривали досуха на роторном испарителе. Сухую пленку растворяли в 1 мл воды. Полученный продукт имел активность FRAP, равную 5735 мг эквивалента витамина С на 100 мл, что примерно в 12 раз превышает активность, измеренную в исходном соке.

Для получения напитка из марулы, обогащенного полифенолами, 15 мл обедненной полифенолами фракции сока (экстракт II) смешивали с выделенной полифенольной фракцией (экстракт III); воду добавляли к конечному объему 25 мл напитка из марулы (содержащего описанные здесь экстракты II и III) с антиоксидантной активностью FRAP, равной 446 мг эквивалента витамина С на 100 мл, из которых 50% приходится на витамин С и 50% полифенолами по сравнению с ~75% и 25% соответственно в исходном соке.

Суммарные полифенолы определяли спектрофотометрически по методу Синглтона, модифицированному для малых объемов [Singleton VL, et al, Am. J. Emology and Viticulture 16:144-158, 1965]. Галловая кислота (ГК) служила эталоном. Исходный раствор ГА готовили в воде с концентрацией 2 мМ. Для стандартной кривой использовали объемы 10, 20, 40 и 60 мкл. Затем результаты выражали в эквивалентах GA (GAE). Иногда пирогаллол заменял ГА в качестве стандарта.

3. Методы in vitro

ИНЖИР. 1  показывает общую концентрацию полифенолов в каждом из отфильтрованного сока марулы, этанольного экстракта высушенного сока марулы (экстракт I) и продукта, полученного путем объединения описанных здесь экстрактов II и III. Общая концентрация составила 7,15, 8,34 и 9,35 мг эквивалентов галловой кислоты (ЭАК)/мл соответственно.

ИНЖИР. 2  представлены хроматограммы ВЭЖХ сока марулы и экстрактов сока. Каждый экстракт сока промывали (1:3) 80% метанолом с добавлением 2 мМ NaF для извлечения антиоксидантов. Суспензию центрифугировали и супернатант перед инъекцией фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Образцы объемом 20 мкл анализировали с использованием системы ВЭЖХ LaChrom Merck Hitachi, состоящей из насоса L7100, печи для колонок L7350 (настроенной на 28°C), смесителя-дегазатора L-7614 и ручного инжектора Rheodyne в сочетании с многоволновым детектором (Jasco MD- 2010 Plus), интерфейс (Jasco LC-Net II/ADC) и научное программное обеспечение (EZChrom Elite Client/Server, версия 3.1.6, сборка 3.1.6.2433). Колонка Purospher®Star RP-18 с концевой крышкой (картридж LichroCART® 250×4 мм, размер частиц 5 мкм) с защитной колонкой Lichrospher®100 RP-18 с закрытой крышкой (картридж LichroCART® 4×4 мм, размер частиц 5 мкм) ) были использованы.

Конец колонки соединяли с коллектором фракций (Pharmacia Fine Chemicals, FRAC-100). Подвижные фазы состояли из (А) фосфорной кислоты (0,1%), рН 2,4 и (Б) метанола; градиент элюции устанавливали на переход от 0 до 100% метанола за 30 минут. Скорость потока составляла 0,6 мл/ ^мин .

Концентрацию витамина С оценивали по площади под соответствующими пиками хроматограммы с использованием витамина С для ВЭЖХ (Fluka) для калибровки. Метанол имел чистоту для ВЭЖХ (LiChrosolv Merck); вода очищена и отфильтрована по известным методикам; фосфорная кислота (Фрутаром) и NaF (Сигма) квалификации ч. д. а. Стандартная библиотека фенолов была создана с использованием катехина, хлорогеновой, кофейной и дубильной кислот от Sigma и 2-гидроксибензойной (салициловой) кислоты, кверцетин-3-β-глюкозида и эллаговой кислоты от Fluka.

Как показывают хроматограммы ВЭЖХ, каждый экстракт I, II, III имел уникальный состав в отношении фенольных соединений [фенольных кислот (ФК) и дубильных веществ (Т)] и витамина С. Три экстракта значительно различались по своему антиоксидантному составу по сравнению с исходным. сок.

Способность продуктов из сока марулы поглощать свободные радикалы также анализировали с помощью анализа DPPH [Malterud KM, Farbort TL, Huse ACE, Bredo Sund R. Антиоксидантные и радикальные эффекты артрахинонов и анторонов. Фармакология. 1993: 47: 77-85]. DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил) представляет собой вещество, генерирующее свободные радикалы, которое широко используется для мониторинга способности различных антиоксидантов поглощать свободные радикалы (способность соединения отдавать электрон). Радикал DPPH имеет темно-фиолетовый цвет из-за поврежденного электрона, а удаление радикалов может сопровождаться спектрофотометрически потерей поглощения при 517 нм, поскольку образуется бледно-желтая нерадикальная форма.

Аликвоты продукта сока марулы (1,0 мкл) смешивали с 1 мл 0,1 ммоль DPPH/л в этаноле и непрерывно отслеживали изменение оптической плотности при 517 нм. Способность экстрактов сока марулы поглощать свободные радикалы сравнивали со способностью поглощать свободные радикалы отфильтрованным соком марулы. ФИГ. 3А и 3В ).

При концентрации 1,0 мкл/мл профильтрованный сок марулы вызывал 30% снижение оптической плотности при 517 нм, тогда как продукт, полученный путем объединения описанных здесь экстрактов II и III (например, сок марулы, обогащенный высоким уровнем полифенолов) вызывал снижение оптической плотности на 21% при 517 нм. Наиболее замечательную способность поглощать радикалы продемонстрировал экстракт I, который вызывал снижение оптической плотности на 54% при 517 нм ( ИНЖИР. 3А ). При более высоких концентрациях (2,0 мкл/мл) отфильтрованный и центрифугированный сок марулы вызывал снижение оптической плотности на 60% при 517 нм. Точно так же продукт, полученный путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, вызывал снижение оптической плотности на 43% при 517 нм, а наиболее заметную способность поглощать радикалы снова проявлял экстракт I, который вызывал снижение оптической плотности на 89%. плотность при 517 нм ( ИНЖИР. 3Б ).

ЛНП выделяли из плазмы, полученной от здоровых нормолипидемических добровольцев, путем ультрацентрифугирования в прерывистом градиенте плотности [Aviram, M. (1983) Разделение липопротеинов плазмы путем ультрацентрифугирования в прерывистом градиенте плотности у пациентов с гиперлипопротеинемией. Биохим. Мед. 30, 111-118]. ЛПНП промывали при d=1,063 г/мл, подвергали диализу против 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л Na ₂ ЭДТА (рН 7,4) при 4°С. Затем ЛПНП стерилизовали фильтрованием (0,45 мкМ), выдерживали при азота в темноте при 4°С и использовали в течение 2 недель. Концентрацию белка ЛПНП определяли с помощью фенольного реагента Folin. Перед окислением ЛПНП подвергали диализу против не содержащего ЭДТА забуференного фосфатом солевого раствора (PBS), рН 7,4 и при 4°С.

ЛПНП (100 мкг белка/мл) инкубировали в течение десяти минут при комнатной температуре с возрастающими концентрациями экстрактов сока марулы. Затем 5 мкмоль/л CuSO ₄ добавляли и пробирки инкубировали в течение 2 часов при 37°C. В конце инкубации определяли степень окисления ЛПНП путем измерения генерируемого количества веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (TBARS), и перекисей липидов [Aviram M, Vaya J. Маркеры окисления липопротеинов низкой плотности. Методы Энзимол. 2001 г.; 335:244-56; и Buege JA, Aust SD Микросомальное перекисное окисление липидов. Методы Энзимол. 52: 302-310 (1978)]. Тест на перекись липидов (ПД) анализирует образование перекисей липидов по их способности превращать йодид в йод после инкубации в течение 18 часов при 25°С, измеряемой спектрофотометрически при 365 нм [G. Юргенс. Спектрофотометрический анализ перекисей липидов в липопротеинах сыворотки с использованием коммерчески доступного реагента. Дж. Липид Рез. 30: 627-630, 1986].

Окисление ЛПНП измеряли как TBARS ( ИНЖИР. 4А ) или как образование перекисей липидов ( ИНЖИР. 4Б ). Добавление экстрактов сока марулы в возрастающих концентрациях ингибировало окисление ЛПНП, индуцированное ионами меди, дозозависимым образом. ИС ₅₀ (ингибирование окисления ЛПНП на 50%) для профильтрованного и центрифугированного сока марулы составило 0,80 мкл/мл для TBARS ( ИНЖИР. 5А ) и 0,65 мкл/мл для перекисей липидов ( ИНЖИР. 5Б ) формирование. Несколько более низкие результаты были получены для экстракта I (0,50 мкл/мл как для TBARS, так и для образования перекисей липидов). Наоборот, IC ₅₀ значение для продукта, полученного путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, было самым высоким (1,35 и 1,50 для TBARS и для перекисей липидов соответственно).

Макрофаги J-774A.1 предварительно инкубировали с 10 и 30 мкг эквивалентов GAE/мл продуктов из сока марулы, а затем клетки анализировали на их атерогенность, которую оценивали по окислительному статусу макрофагов, поглощению макрофагами липопротеинов, опосредованному ЛПВП оттоку холестерина. и биосинтез холестерина

Окислительный статус макрофагов определяли методом проточной цитометрии с дихлорфлуоресцин-диацетатом (DCFH-DA). DCFH-DA представляет собой неполярный краситель, который диффундирует в клетки. В клетках он гидролизуется в нефлуоресцентное производное 2',7'-дихлорфлуоресцин (DCFH), которое является полярным и захватывается клетками. При окислительном стрессе DCFH окисляется до DCF, который представляет собой флуоресцентное соединение. Макрофаги J774 A.1 (2×10 ⁶ ) инкубировали с 2,5×10 ^-5 моль/л DCFH-DA в течение 30 минут при 37°C. Реакцию останавливали промывкой PBS при 4°C. Флуоресценцию клеток определяли с помощью прибора проточной цитометрии (FACS-SCAN, Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). ). Измерения проводились при длине волны от 510 до 540 нм после возбуждения клеток при длине волны 488 нм аргоновым ионным лазером.

Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при 37°С с экстрактом I и отфильтрованным соком марулы снижала клеточный окислительный стресс, измеренный с помощью анализа DCFH, на 6% и 7% соответственно. Продукт, полученный путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, не оказывал влияния на состояние окислительного стресса макрофагов ( ИНЖИР. 6 ).

LDL (1 мг/мл) инкубировали в течение 18 часов при 37°C с 5 мкмоль/л свежеприготовленного CuSO ₄ . Окисление останавливали охлаждением до 4°С. Степень окисления ЛПНП определяли с помощью анализа TBARS.

LDL и Ox-LDL были конъюгированы с фторизотиоцианатом (FITC) для изучения клеточного поглощения. Липопротеины (2,5 мг белка/мл) подвергали диализу в течение ночи при 4°С против нескольких смен боратного буфера, содержащего 0,1 М бората, 25 мМ тетрабората натрия, 75 мМ NaCl, рН 8,6. Перед конъюгацией (1 ч) рН диализного буфера изменяли до 9,4. Изотиоцианат флуоресцеина (FITC; Sigma-Aldrich) растворяли в диметилформамиде (Merck) и добавляли по каплям к раствору липопротеинов до конечной концентрации 0,2 мг/мл, а затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Липопротеины, конъюгированные с ФИТЦ, отделяли от неконъюгированного ФИТЦ эксклюзионной хроматографией на колонке PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech), элюируя 10 мМ фосфатным буфером, рН 8,0. Липопротеины, меченные FITC (2 мг/мл), сразу же использовали в исследованиях поглощения.

Макрофаги J774 A.1 инкубировали при 37°С в течение 3 часов с FITC-конъюгированным ЛПНП или Ох-ЛПНП в конечной концентрации 25 мкг белка/мл. Поглощение липопротеина определяли с помощью проточной цитометрии. Измерения клеточной флуоресценции, определяемой с помощью FACS, проводились при длине волны от 510 до 540 нм после возбуждения клеток при длине волны 488 нм с помощью аргонового ионного лазера. Клеточная флуоресценция измерялась по средней интенсивности флуоресценции (MFI).

Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при 37°С с продуктами сока марулы (10 мкг/мл GAE) не влияла на поглощение ЛПНП макрофагами. При более высокой концентрации 30 мкг/мл ГАЭ только продукт, содержащий описанные здесь экстракты II и III, снижал поглощение ЛПНП макрофагами на 9% ( ИНЖИР. 7 ). Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при 37°С с экстрактом I, продуктом, полученным путем объединения описанных здесь экстрактов II и III и отфильтрованного сока марулы, либо при 10 мкг/мл GAE, либо при 30 мкг/мл. GAE снижал поглощение Ox-LDL макрофагами на 12% и 7% (экстракт I), на 27% (сок марулы с высоким содержанием полифенолов) и на 8% и 6% (фильтрованный сок марулы) соответственно. ИНЖИР. 8 ).

Макрофаги J774 A.1 инкубировали с [ ³ H]-меченым холестерином (2 мкКи/мл) в течение 1 часа при 37°C с последующим промыванием клеток ледяным PBS (×3) и дальнейшей инкубацией в отсутствие или в присутствии 100 мкг белка ЛПВП/мл в течение 3 часов при 37°С. Количественно определяли клеточные и средние [ ³ H]-метки и рассчитывали опосредованный ЛПВП отток холестерина как отношение [ ³ H]-метки в среде/( [ ³ H]-метка в среде+[ ³ H]-метка в клетках). Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при 37°С с отфильтрованным соком марулы (10 мкг/мл GAE) увеличивала отток холестерина из макрофагов в ЛПВП на ~10%. Тем не менее, все другие продукты из сока марулы не влияли на отток холестерина, опосредованный ЛПВП, при любой используемой концентрации. ИНЖИР. 9 ).

Макрофаги J774 A.1 инкубировали с [ ³ H]ацетатом с последующей экстракцией клеточных липидов смесью гексан:изопропанол (3:2, об./об.) и разделением с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем. Пятна неэтерифицированного холестерина визуализировали парами йода, соскабливали в сцинтилляционные пробирки и определяли радиоактивность. Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при 37°C с экстрактом I, продуктом, полученным путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, и соком марулы после фильтрации, все при концентрации 30 мкг/мл GAE, уменьшенной биосинтеза холестерина в макрофагах на 18%, 7% и 8% соответственно ( ИНЖИР. 10 ).

Новорожденных крыс Wistar получали от Harlan Laboratories. Культуры первичных крысиных астроцитов получали из коры головного мозга 1-2-дневных новорожденных крысят Вистар. Эта процедура была одобрена Институциональным комитетом по уходу и использованию животных. Астроциты высевали в 24-луночные планшеты по 100000 или 80000 клеток/0,5 мл/лунку соответственно. Все эксперименты проводились в присутствии 2% сыворотки (FCS). Исходную среду клеток отсасывали и к клеткам добавляли свежую среду. Разведения H ₂ O ₂ и соки марулы в питательной среде готовили из исходных растворов непосредственно перед каждым экспериментом и сразу же использовали. Каждую обработку проводили в четырех экземплярах. Конечная концентрация H ₂ O ₂ составлял 200 мкМ.

Анализы культуры нейрональных клеток

Определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток определяли с использованием коммерческого набора для колориметрического анализа (поставляемого компанией Roche) на основе измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), высвобождаемой из цитозоля поврежденных клеток в супернатант.

Защитные эффекты экстрактов. Чтобы определить оптимальные условия (с точки зрения времени и дозы) для проявления предполагаемого защитного действия соков, клетки предварительно обрабатывали разными количествами каждого сока в течение разных периодов времени и защитным действием продуктов против оксидантного стресса. генерируется H ₂ O ₂ были оценены. Соки (в разведении 1:125, 1:500, 1:800 и 1:4000) либо одновременно добавляли H ₂ O ₂ или предварительно инкубировали в течение двух часов с клетками перед добавлением. Токсичность контролировали через 20 часов. ИНЖИР. 11  показывает, что при всех испытанных концентрациях и для всех сокосодержащих продуктов одновременное добавление в соки H ₂ O ₂ не является защитным. Однако предварительная инкубация в течение 2 часов с клетками до H ₂ O ₂ добавление привело к защитному действию всех соков, при этом экстракт I показал наиболее эффективное защитное действие при использовании в низких концентрациях (1:4000).

Эксперименты с экстрактами марулы при низких концентрациях (разведения 1:1000-1:8000). Следующие эксперименты проводились с более низкими концентрациями продуктов (разведения 1:1000-1:8000), составляющими ~55-450 мкг/100 мл витамина. C эквиваленты.

Исследовали влияние периода предварительной инкубации (2 часа против 6 часов) клеток с сокосодержащими продуктами и концентрации продукта (1:1000-1:8000). ИНЖИР. 12  показывает, что в то время как предварительная инкубация в течение 2 часов с экстрактом I обеспечивала только ~20% защиту при всех испытанных концентрациях, предварительная инкубация в течение 6 часов приводила к более чем 80% защите.

В другом эксперименте влияние времени инкубации и концентрации тестировали с 2 разведениями (1:1000 или 1:4000) каждого сока, фильтрованного сока марулы и экстракта I за 2 или 6 часов до добавления H ₂ О ₂ ( ИНЖИР. 13 ). Экстракт I оказался наиболее эффективным (защита 70%). Отфильтрованный сок марулы также проявлял значительную защитную активность (защита 40%).

4. Клинический протокол

Для исследования были набраны 10 здоровых добровольцев (табл. 1), некурящих, без метаболических нарушений, с уровнем холестерина в плазме ниже 200 мг/дл и не получавших медикаментозного лечения. Все испытуемые подписали форму согласия перед включением в исследование. Протокол исследования был одобрен Хельсинкским комитетом Рамбама (№ 2452).

Все участники потребляли 200 мл пастеризованного сока в день во время основного приема пищи в течение 3 недель. Все испытуемые, включенные в исследование, продолжали вести привычный образ жизни. Артериальное давление измеряли в нулевое время (до включения в исследование), через 3 недели и в конце исследования (после 4 недель вымывания). Образцы крови (25 мл) были собраны для анализа в нулевое время (исходный уровень — до включения в исследование), через 3 недели употребления сока марулы и через 4 недели после окончания употребления сока (вымывание).

Все образцы сыворотки крови замораживали при -80°С до анализа. Биохимические анализы в сыворотке проводились с использованием имеющихся в продаже диагностических наборов и включали измерение уровня глюкозы, кальция, функции почек (АМК, креатинина и электролитов натрия и калия), функции печени (КК, АСТ и общий билирубин), общего холестерина, ЛПВП. — холестерин, холестерин ЛПНП и общие триглицериды. Уровни мочевой кислоты (как возможного антиоксиданта) в сыворотке измеряли с использованием имеющегося в продаже набора.

Анализы окислительного стресса образцов сыворотки

Железовосстанавливающая антиоксидантная способность (FRAP): рабочий реагент FRAP готовили путем смешивания 25 мл ацетатного буфера, 2,5 мл раствора 2,4,6-трипиридил-s-триазина (TPTZ) и 2,5 мл раствора FeCL ₃ *6H ₂ O. Водные растворы 1 мМ FeSO ₄ *7H ₂ O в концентрациях 5, 10, 20, 30, 40, 50 и 100 мМ использовали для стандартной калибровочной кривой. Реагент FRAP (свежеприготовленный) нагревали до 37°С и считывали бланк реагента при 593 нм спектрофотометрически. Образец сыворотки (30 мкл) смешивали с 90 мкл воды. Затем добавляли 900 мкл реагента FRAP и быстро перемешивали. Поглощение измеряли через 0,5 секунды и каждые 15 секунд в течение 4 минут. Изменение оптической плотности (A _{593 нм} ) между конечной и начальной оптической плотностью рассчитывали для каждого образца и затем соотносили с Fe ^+2. концентрация на стандартной кривой (тестируется параллельно).

Перекисное окисление липидов сыворотки

Сыворотку разбавляли 1:4 (об:об) фосфатно-солевым буфером (PBS) и затем инкубировали в отсутствие или в присутствии 100 ммоль/л генератора свободных радикалов 2,2'-азобис-2-амидинопропана гидрохлорида (AAPH). в течение 2 часов при 37°С. Перекисное окисление липидов в сыворотке определяли путем измерения образовавшегося количества веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (TBARS), и перекисей липидов с использованием спектрофотометрических методов. Тест на перекись липидов (PD) анализирует образование перекисей липидов по их способности превращать йодид в йод после инкубации в течение 18 часов при 25°С, измеряемой спектрофотометрически при 365 нм.

Как показывают результаты исследования, потребление не оказало существенного влияния на кровяное давление; уровни глюкозы и кальция в сыворотке существенно не изменились после употребления, и продолжительное потребление не оказало существенного влияния на тесты функции почек. Точно так же потребление привело к практически неизменному уровню электролитов в крови и функции печени. Тем не менее, уровни триглицеридов в сыворотке снизились на 7% после употребления, причем эффект сохранялся после 4-недельного периода вымывания (таблица 2).

Потребление в течение 3 недель достоверно (p<0,02) снижало концентрацию общего холестерина в сыворотке крови на 8% (таблица 3).

Это снижение может быть связано со значительным (p<0,01) снижением уровня холестерина ЛПНП на 17%. Однако это снижение не сохранялось после периода вымывания, поскольку уровни общего холестерина, а также холестерина ЛПНП возвращались к исходным уровням через 4 недели периода вымывания, в течение которых субъект не употреблял сок. Уровень ЛПВП-холестерина в сыворотке значительно (p<0,03) увеличился на 10% после употребления сока, и это снижение сохранялось, хотя и в меньшей степени (всего на 7%), после периода вымывания.

В таблице 4 показано влияние на сывороточный окислительный стресс. Образцы сыворотки подвергали окислению, вызванному AAPH. Образование перекиси липидов было значительно (p<0,03) снижено в образцах сыворотки, полученных после употребления в течение 3 недель. Однако этот эффект не сохранялся после периода вымывания. В образцах сыворотки, полученных после употребления, «антиоксидантная сила», измеренная с помощью анализа FRAP, увеличивалась в течение периода потребления и еще больше увеличивалась, достигая значительного повышения на 8% после периода вымывания. Снижение окислительного стресса в сыворотке может быть результатом снижения концентрации липидов в сыворотке (меньшее количество субстрата, доступного для окисления, а также действие мощных антиоксидантов сока марулы).

Влияние потребления пастеризованного сока на окислительный стресс в сыворотке крови обобщено в ФИГ. 14А-Б . Образцы сыворотки подвергали окислению, вызванному AAPH. Образование перекиси липидов ( ИНЖИР. 14А ) было значительно (p<0,03) снижено в образцах сыворотки, полученных после употребления сока в течение 3 недель. Этот эффект не сохранялся после периода вымывания. Антиоксидантная мощность, измеренная с помощью анализа FRAP ( ИНЖИР. 14Б ), увеличился в образцах сыворотки, полученных после употребления пастеризованного сока марулы, и неожиданно увеличился еще больше, достигнув значительного повышения на 8% после периода вымывания.